BIOMOL LCS/2010:TP 6: Difference between revisions
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#Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. | |||
#É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? | #Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. | ||
#Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. | |||
#É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? | |||
#Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. | |||
===Exercício 2 – Mapas de restrição=== | ===Exercício 2 – Mapas de restrição=== | ||
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As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. | As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. | ||
Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html<br><br> | Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html<br><br> | ||
#A que correspondem as bandas azuis no gel? | #A que correspondem as bandas azuis no gel? | ||
#Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? | #Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? | ||
#Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? | #Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? | ||
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===Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações=== | ===Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações=== |
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Digestão de DNA com enzimas de restrição
As enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível.
As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica. Existem comercializadas perto de 100 enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma sequência única de nucleótidos.
As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo, EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E). espécie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd.
Exercício 1 – Extremidades e ligações
Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):
Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT
- Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?
- Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.
- É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?
- Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.
Exercício 2 – Mapas de restrição
As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose.
Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
- A que correspondem as bandas azuis no gel?
- Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?
- Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?
- Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?
Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.
- Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?
- Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas:
- Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?
- Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?
Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:
- DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000
- DNA x HindIII = 5500 + 4500
- DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500
- Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.
- Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.
Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:
- uma enzima de corte único;
- uma enzima com dois cortes;
- uma enzima que não corta neste DNA.
(ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA
GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC
AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG
CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC
TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT
CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA
CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA
CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT
GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA
AAAAAAAAA)
Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações
As variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense.
Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença.
O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.
- Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.
- Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.
- Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).