Biomod/2012/TeamJapan/Sendai/Results/Electrophoresis: Difference between revisions
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STAGE１目的：脂質でDNAオリガミが引っ付くかの確認<br/> | <font size=2>'''STAGE１目的：脂質でDNAオリガミが引っ付くかの確認'''</font><br/> | ||
①BIOMOD2011のフィールドおよび2D robotを製作する。 | |||
昨年BIOMODで用いたDNAorigamiのレースフィールドおよびロボット本体であった三角柱を作成する。 | 昨年BIOMODで用いたDNAorigamiのレースフィールドおよびロボット本体であった三角柱を作成する。 | ||
参考[http://openwetware.org/wiki/Biomod/2011/TeamJapan/Sendai/Design]<br/> | 参考[http://openwetware.org/wiki/Biomod/2011/TeamJapan/Sendai/Design]<br/> | ||
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! style="background:#efefef;" | ステイプル( | ! style="background:#efefef;" | ステイプル(2D robot)① | ||
! style="background:#efefef;" |ステイプル( | ! style="background:#efefef;" |ステイプル(2D robot)② | ||
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| M13(84nM) 10μL | | M13(84nM) 10μL | ||
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| ステイプル( | | ステイプル(2D robot)① 10μL | ||
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フィールドステイプルと同様、95°C~25°Cまで１°C2分の条件でサーマルサイクラーにかけ、アニーリングを行う。 | フィールドステイプルと同様、95°C~25°Cまで１°C2分の条件でサーマルサイクラーにかけ、アニーリングを行う。 | ||
②DNAオリガミの精製を行う。（PEG沈、エタ沈） | これらを高速AFMにより観察した結果が以下Figure1.1 Figure1.2である。 | ||
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|[[Image:AFM_field.jpg|250px|left|thumb|Figure1.1 Field DNA origami]] | |||
|[[Image:AFM_sankaku.jpg|250px|right|thumb|Figure1.2 2D robot]] | |||
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field DNA origamiはかなりの数が作成できていることが確認できた。しかしながら2D robotは複数の欠片が生成できただけで目的の形は観察されなかった。<br/> | |||
よって以下の実験はfield DNA origami を用いて進める。<br/> | |||
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<font size=2>'''②DNAオリガミの精製を行う。（PEG沈、エタ沈）'''</font><br/> | |||
Field DNA origamiの作成はできたが、溶液中には余分なステイプルが多々入っており、これらが脂質を加えた際、悪影響を及ぼす可能性も挙げられる。<br/> | |||
ゆえに、アニーリングを完了したステイプル(field)②の溶液をPEG沈殿、エタノール沈殿を行い生成する。<br/> | |||
精製した結果field DNA origamiに悪影響が出るとも限らないので、その点も確認する。<br/> | |||
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②-1 PEG（ポリエチレングリコール）沈殿 | |||
水溶性のポリエーテルであるポリエチレングリコール（PEG）を用いたDNAの沈殿法であり、高分子量のDNAを優先的に沈殿させ（100bp以下)のDNAの除去が可能である。<br/> | |||
＜精製手順＞ | |||
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! style="background:#efefef;" | PEG沈殿 溶液 | |||
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| 50% ポリエチレングリコール 6μL | |||
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| ステイプル(field)② 10μL | |||
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| mQ 13.7μL | |||
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|MgCl<sub>2</sub> 0.3μL | |||
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|計 30μL | |||
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③引っ付けるためにどのような脂質を用いるか決める。 | ③引っ付けるためにどのような脂質を用いるか決める。 | ||
④加える脂質のパラメータを決める。用いるDNAに対しての濃度の決定。 | ④加える脂質のパラメータを決める。用いるDNAに対しての濃度の決定。 | ||
⑤脂質を加えて引っ付くかどうかを確認する。 | ⑤脂質を加えて引っ付くかどうかを確認する。 | ||
Revision as of 23:03, 9 August 2012
＜実験＞
STAGE１目的：脂質でDNAオリガミが引っ付くかの確認
①BIOMOD2011のフィールドおよび2D robotを製作する。
昨年BIOMODで用いたDNAorigamiのレースフィールドおよびロボット本体であった三角柱を作成する。
参考[1]
実験条件
| ステイプル(field)① | ステイプル(field)② |
|---|---|
| フィールドステイプル222本 各1μL | M13(84nM) 4.8μL |
| mQ 33μL | 10×TAE Mg2+ 10μL |
| ステイプル(field)① 10μL | |
| mQ 75.2μL | |
| 計 250μL | 計 100μL |
ステイプル(field)②を95°C~25°Cまで１°C2分の条件でサーマルサイクラーにかけ、アニーリングを行う。
| ステイプル(2D robot)① | ステイプル(2D robot)② |
|---|---|
| 2D robotステイプル33本 各1μL | M13(84nM) 10μL |
| mQ 92μL | 5×TAE Mg2+ 20μL |
| ステイプル(2D robot)① 10μL | |
| mQ 60μL | |
| 計 125μL | 計 100μL |
フィールドステイプルと同様、95°C~25°Cまで１°C2分の条件でサーマルサイクラーにかけ、アニーリングを行う。
これらを高速AFMにより観察した結果が以下Figure1.1 Figure1.2である。
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field DNA origamiはかなりの数が作成できていることが確認できた。しかしながら2D robotは複数の欠片が生成できただけで目的の形は観察されなかった。
よって以下の実験はfield DNA origami を用いて進める。
②DNAオリガミの精製を行う。（PEG沈、エタ沈）
Field DNA origamiの作成はできたが、溶液中には余分なステイプルが多々入っており、これらが脂質を加えた際、悪影響を及ぼす可能性も挙げられる。
ゆえに、アニーリングを完了したステイプル(field)②の溶液をPEG沈殿、エタノール沈殿を行い生成する。
精製した結果field DNA origamiに悪影響が出るとも限らないので、その点も確認する。
②-1 PEG（ポリエチレングリコール）沈殿
水溶性のポリエーテルであるポリエチレングリコール（PEG）を用いたDNAの沈殿法であり、高分子量のDNAを優先的に沈殿させ（100bp以下)のDNAの除去が可能である。
＜精製手順＞
| PEG沈殿 溶液 |
|---|
| 50% ポリエチレングリコール 6μL |
| ステイプル(field)② 10μL |
| mQ 13.7μL |
| MgCl2 0.3μL |
| 計 30μL |
③引っ付けるためにどのような脂質を用いるか決める。 ④加える脂質のパラメータを決める。用いるDNAに対しての濃度の決定。 ⑤脂質を加えて引っ付くかどうかを確認する。
