Biomod/2012/TeamSendai/Method: Difference between revisions

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<a name="Tube"></a><h1>Tube</h1>
<a name="Tube"></a><h1>Tube</h1>
<h2>We can create tube</h2>
<h2>Making the Gate</h2>
<p>
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<img src="http://openwetware.org/images/e/e4/Format_comparison.jpg" alt="boiled water annealing" align="right" width="555px" height="381px">
<img src="http://openwetware.org/images/e/e4/Format_comparison.jpg" alt="boiled water annealing" align="right" width="555px" height="381px">
筒のstaplesをM13mp18と混ぜて、お湯及びサーマルサイクラーを使ってアニーリングをした。サーマルサイクラーのほうのプログラムはショーンでおこなった。電気泳動の結果（はる）、お湯よりもサーマルサイクラーのほうがバンドがはっきり出ていて収率がよいことが分かった。
We mixed M13mp18 and staples of tube and annealed them. We tried two annealing method. The one is annealing with boiled water, and the other is annealing based on ” A Logic-Gated Nanorobot for Targeted Transport of Molecular Payloads”. And we did electrophoresis using this sample. This results is following. As a result of the experiment, we got that the Shawn annealing was better than annealing with boiled water.
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<img src=" http://openwetware.org/images/3/33/Tutu_AFM_triming.jpg" alt="AFM image " align="right" width="290px" height="303px">
<img src=" http://openwetware.org/images/3/33/Tutu_AFM_triming.jpg" alt="AFM image " align="right" width="290px" height="303px">
<p>
<p>
これをAFMで観察すると、（はる）四角形の構造を観察することができた。このこと（六角柱のサイズは縦横高さすべて近いのでＡＦＭで上からたたくと四角に見えると考えられるので）から、筒ができていると考えられる。</br>
And the tube structure made on Shawn annealing was observed by AFM. This result is following.
</br>
This object whose shape is rectangular object may be tube because we consider that the shape of the tube is transformed when it is crushed by cantilever.  
<br>
We mixed M13mp18 and staples of tube and annealed them. We tried two annealing method. The one is annealing with boiled water, and the other is annealing based on ” A Logic-Gated Nanorobot for Targeted Transport of Molecular Payloads”. And we did electrophoresis using this sample. This results is following. As a result of the experiment, we got that the Shawn annealing was better than annealing with boiled water. And the tube structure made on Shawn annealing was observed by AFM. This result is following.</br>
This object whose shape is rectangular object may be tube because we consider that the shape of the tube is transformed when it is crushed by cantilever.
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</p>
</p>
<h2>もっともできやすいアニーリング条件は？</h2>
<h3>アニーリング時間は？</h3>
<p>
アニーリングの温度やMg濃度を変化させてアニーリングをし、電気泳動によって構造物のでき方を比較した。Mg濃度は、8mMと12.5mMで比べた。その結果、12.5mMの方が収率がよかった。(写真がないので実験して新たに撮る) </br>
</br>
<br>
Then,we tried various pattern of annealing condition;the concentration of Mg and the speed of cooling.First,we compared the concentration of Mg is 8mM or 12.5mM.For the result, the yield of 12.5mM was higher than 8mM. <br clear="right">
</p>
<h2>アニーリング時間は？</h2>
<img src=" http://openwetware.org/images/5/51/Format_40h_and_20h.jpg" alt=20h and 40h " align="right" width="450px" height="273px">
<img src=" http://openwetware.org/images/5/51/Format_40h_and_20h.jpg" alt=20h and 40h " align="right" width="450px" height="273px">
<p>
<p>
続いてアニーリングの温度条件を比較した。私たちは２０hのアニーリング、４０hのアニーリングやショーンの論文に基づいたアニーリングを行った。その結果、２０h、４０hアニーリングは電気泳動でバンドは確認できたが、
Next,we compared the speed of cooling.We tried 20h annealing,(２０hアニーリングの条件を書く)40h annealing,（４０hアニーリングの条件を書く）and the annealing based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1].For the result, the tube annealed by 20h annealing and 40h annealing could been seen as a band when we did electrophoresis but could not been seen when we observed by AFM.On the other hand,when we observed the tube annealed by the condition based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1] by AFM, we could find some structual object.In general, we considered the best condition of annealing is next;the condition of Mg is 8mM and the speed of cooling is based on the article proposed by Dr.Shown.     
AFMでは何も確認できず、ショーンの論文に基づいたアニーリングはAFMで何らかの構造体が確認できた。その結果ショーンで行くことに決めた。
</br>
</br>
<br>
Next,we compared the speed of cooling.We tried 20h annealing,(２０hアニーリングの条件を書く)40h annealing,（４０hアニーリングの条件を書く）and the annealing based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1].For the result, the tube annealed by 20h annealing and 40h annealing could been seen as a band when we did electrophoresis but could not been seen when we observed by AFM.On the other hand,when we observed the tube annealed by the condition based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1] by AFM, we could find some structual object.In general, we considered the best condition of annealing is next;the condition of Mg is 8mM and the speed of cooling is based on the article proposed by Dr.Shown.     
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</p>
</p>


<h2>筒にコレステロールをつけた</h2>
<h3>Adding  cholesterol to the Gate</h3>
<img src="http://openwetware.org/images/3/32/Format_coleste_tutu.jpg" alt=コレステ筒" align="right" width="450px" height="360px">
<img src="http://openwetware.org/images/3/32/Format_coleste_tutu.jpg" alt=コレステ筒" align="right" width="450px" height="360px">
<p>
<p>
リポソームに付けるために筒の周りにコレステロールを修飾できる筒をアニーリングしたところ電気泳動の結果は、筒とほぼ同じであった
Next,we tried to create the tube which can be decorated with cholesterol to connect it with liposome. We call this tube “connect-able tube”.When we annealed the connect-able tube and did electrophoresis,the band could be seen at the similar position compared with normal tube. For this, we consider the connect-able tube also may be created and we could find many guranular objects when we observed the connect-able tube by AFM.  
よってコレステロール修飾できる筒も普通の筒と同様にできていると考えられる。（はる）AFMで確認すると、米粒状のものが多数観察できた。</br>
</br>
<br>
Next,we tried to create the tube which can be decorated with cholesterol to connect it with liposome. We call this tube “connect-able tube”.When we annealed the connect-able tube and did electrophoresis,the band could be seen at the similar position compared with normal tube. For this, we consider the connect-able tube also may be created and we could find many guranular objects when we observed the connect-able tube by AFM.
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</p>
</p>

Revision as of 02:08, 25 October 2012

<html> <head> 

   <title>Team Sendai Top</title>
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  1. menu li

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  1. menu li:hover > a

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/* Sub-menu */

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  1. menu ul ul

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  1. menu ul a:hover

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/* Clear floated elements */

  1. menu:after

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/*目次*/ div#mokuji {width: 1000px; margin-left: auto; margin-right: auto; background-color: #f5f5dc}

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ol#mokuji {font-size: 1.00em; margin-left: 0; padding-left: 0}



</style> </head>

<body> <div id="Container">

<!-- Menu --> <ul id="menu"> <li><a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/Tohoku/Team_Sendai ">Top</a></li> <li><a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Idea ">Project</a></li> <li><a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Simulation">Simulation</a> </li> <li><a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Design">Design</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Experiment ">Experiment</a> <ul> <li><a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Method">Method</a> <ul> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result#Porter">Porter</a> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result#Cylinder">Cylinder</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result# Vesicle">Vesicle</a> </li> </ul> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result">Result</a> <ul> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result#Porter">Porter</a> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result#Cylinder">Cylinder</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Result# Vesicle">Vesicle</a> </li> </ul> </li> </ul> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Achievement">Achievement</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Diary">Diary</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Team ">Team</a> </li> <li> <a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/FAQ">FAQ</a> </li> </ul>


<!-- コンテンツ --> <div id="Content"> <h1>まず始めにフローチャート？</h1>


<h1>書き方</h1> <p>次のような流れで書く</p> <p> 1 何を調べるための実験か、人目でわかるように目的を書く。図を使ってもいい。 </p> <p> 2 結果をさらっと説明。ランチョンミーティングの時に使ったスライドが参考になるかもしれない。 </p> <p> 3 もっと知りたい人のためにさらに詳しい考察。 </p> <p> 4 結果,何がわかりました。 </p>





</br> </br> </br> </br> </br> </br> </br> </br> </br> </br> </br>



<a name="Porter"></a><h1>Porter</h1> <h2>Target is transported by hybridization</h2> <img src="http://openwetware.org/images/0/0f/Format_selector_electorophoresis.jpg" alt="transported selector" align="right" width="590px" height="408px"> <p> この画像はハイブリダイゼーションで物質の移動が可能であるということを示すものである。</br> この実験はLoop1やToeAとハイブリダイズしたターゲットが、さらに相補的な配列を持つLoopBとToeBにそれぞれ移動できるかどうかを示すために行った実験である。 >><a href="">実験に使ったDNAの配列</a></br> ターゲットとPorterを結合させる時間のために、混ぜた後15分おいている。Lane 7を例にとると、Targetとloop1を混ぜたあと15分放置し、その後Loop2を混ぜ、さらに15分放置して泳動にかけている。この手順により、ターゲットの移動の有無が確認できる。この実験はTargetがPorterの1/2の量であるように調整している。　 >><a href=" http://openwetware.org/wiki/Biomod/2012/TeamSendai/Method#Target transportation">Click for more detail about this protocol</a></br> Lane 6を見ると、Targetのみのバンドが消え、Loop 1のバンドの上に新たなバンドが現れていることがわかる。このバンドはTargetとLoop1の結合体由来のものであると考えられる。</br> Lane7を見ると、TargetとLoop1の結合体のバンドの下に新たにバンドが現れている。これがTargetとLoop2の結合体のバンドであると考えられる。Lane6でTargetのバンドが無くなっていたことから、このTargetとLoop2のバンドのTargetはほぼ全てLoop1から移動してきたものであると考えられる。</br> Lane8の一番上のバンドは、Loop2に二本のTargetが結合したものだろう。（nupackか何かで調べられないか）</br> Lane9を見ると、薄くて見えづらいがTargetのバンドの下に薄くバンドが出ている。Lane4にも同じ位置にバンドが薄らと出ていることからこれはToeAのバンドである。TarとToeAのバンドの他に、バンドが確認できないことから、15分では中々結合しないのではないかと考えられる。以上のことから、ターゲットの捕集にはループ構造が向いていると考えられる。</br> 結論：</br> ・ハイブリダイゼーションにより物質の移動ができる。</br> ・捕集に関してはループ構造を使ったほうが効率が良い。</br> </p>

<h2>移動に最適なのはLoopかToeか</h2> <p> ループ構造が捕集に向いているのはわかったので、移動には何が向いているか考えたい。24日までに結果を出す。>><a href="">Click for more detail about this protocol</a></br> </p>

<h2>セレクターは筒に入るか否か</h2> <p> 24日までにきれいな結果を出す。 >><a href="">Click for more detail about this protocol</a></br> </p>


<a name="Tube"></a><h1>Tube</h1> <h2>Making the Gate</h2> <p> <img src="http://openwetware.org/images/e/e4/Format_comparison.jpg" alt="boiled water annealing" align="right" width="555px" height="381px"> We mixed M13mp18 and staples of tube and annealed them. We tried two annealing method. The one is annealing with boiled water, and the other is annealing based on ” A Logic-Gated Nanorobot for Targeted Transport of Molecular Payloads”. And we did electrophoresis using this sample. This results is following. As a result of the experiment, we got that the Shawn annealing was better than annealing with boiled water. <br clear="right">

</p> <img src=" http://openwetware.org/images/3/33/Tutu_AFM_triming.jpg" alt="AFM image " align="right" width="290px" height="303px"> <p> And the tube structure made on Shawn annealing was observed by AFM. This result is following. This object whose shape is rectangular object may be tube because we consider that the shape of the tube is transformed when it is crushed by cantilever. <br clear="right">

</p> <h3>アニーリング時間は？</h3> <img src=" http://openwetware.org/images/5/51/Format_40h_and_20h.jpg" alt=20h and 40h " align="right" width="450px" height="273px"> <p> Next,we compared the speed of cooling.We tried 20h annealing,(２０hアニーリングの条件を書く)40h annealing,（４０hアニーリングの条件を書く）and the annealing based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1].For the result, the tube annealed by 20h annealing and 40h annealing could been seen as a band when we did electrophoresis but could not been seen when we observed by AFM.On the other hand,when we observed the tube annealed by the condition based on the article proposed by Dr. Shown Douglas [1] by AFM, we could find some structual object.In general, we considered the best condition of annealing is next;the condition of Mg is 8mM and the speed of cooling is based on the article proposed by Dr.Shown. <br clear="right"> </p>

<h3>Adding cholesterol to the Gate</h3> <img src="http://openwetware.org/images/3/32/Format_coleste_tutu.jpg" alt=コレステ筒" align="right" width="450px" height="360px"> <p> Next,we tried to create the tube which can be decorated with cholesterol to connect it with liposome. We call this tube “connect-able tube”.When we annealed the connect-able tube and did electrophoresis,the band could be seen at the similar position compared with normal tube. For this, we consider the connect-able tube also may be created and we could find many guranular objects when we observed the connect-able tube by AFM. <br clear="right"> </p>

<a name="Vesicle"></a><h1>Vesicle</h1> <h2>筒の作製</h2> Min-gateとM13のバンドが違っていたため、min-gateができているといえる。また、コレステロール修飾したmin-gateとただのmin-gateのバンドが違っていたため、コレステロールが修飾されていることがわかる。</br> 泳動条件は0.7%アガロースゲル、100V40min。</br>

<h2>刺さったことの確認</h2> ヘキストに関してはDNAの有無で蛍光に差があったためDNAが存在していることはわかった。しかし、膜表面ではなくvesicle全体が光っているため、表面だけに存在しているとは言えず、また膜にくっついているかわからなかった。</br> 　ルシファーイエローに関しては、NCと同じであったため、穴があいているとはいえなかった。</br> <h3>脂質の成分</h3> 　　DOPC　5mM 10μL</br> DSPE-PEG2000　0.5mM　1μL</br> フルクトース　10mM　50μL</br> 　筒　20μL</br> 　クロロホルム　70μL　(筒なしの場合はクロロホルム90μL) </br> これを乾かして、</br> 　1×ヘキスト　1.25μL</br> 　1×2/100mMルシファーイエロー　2.5μL</br> 　1×TAE　Mg2+　121.25μL</br> で戻す。</br> これを蛍光顕微鏡で観察した。</br> </p>

<h2>昔の文章</h2> <p> We use fluorescein to confirm that the tube insert into the liposome. For example, We put Lucifer Yellow fluorescein into big liposome and　made a hole using the α- Hemorijin into liposomes. Then, we observed that fluorescein was flowing out from it. Alpha-hemolysin is toxin which makes a hole in the cell and is often used in experiments liposome system. The way of the experience of the protein α-hemolysin was dissolved in 150mM KCL, 10 mM HPES and kept at 4℃ for up to　6 months. And 0.6 μL of 1 mg/mL α-hemolysin solution was added directly to a 6 μL sample on the microscope slide. The figure shows that fluorescein flowing out from a liposome. Therefore, we are sure that observing fluorescein would be a confirmatory experiment which our tube stuck to the liposome or not.</br> （リポソームに筒が刺さっているかどうかを確かめるために、蛍光分子を使用する。実験として、ルシファーイエロー（染色液）を大きなリポソームに入れて、リポソームにαヘモリジンを使用して穴を開け、リポソームから蛍光分子が流れ出てくるところを観察した。αヘモリジンは、細胞に穴を開ける毒素の一つで、リポソーム系の実験でよく使われている。実験結果としては、写真の通り観察できたので、筒がリポソームに刺さったかどうかを確かめる方法として使用できることが分かった。ネガコンの写真 ポジコンの写真）</br>

We also can confirm that by adding hoechst to the sample, the tube is on the membrane of liposome or not, and confirm that fluorescein does not leak from the hole in nature.</br> （また，サンプルにhoechstを添加することにより，ＤＮＡ構造体がliposome膜上にあるか否かが判断でき，自然に開いた穴で漏れ出していないことを確認することができる．）</br>

We examined the appropriate composition of the liposome. And we decided the composition; DOPC : DSPE-PEG2000 : Fructose = 100:1:1000.</br> （リポソームの適切な組成を調べ、DOPC：DSPE－PEG2000：Fructose = 100:1:1000 という組成に決めた。）</br>

Lipids 0.4mM</br> Inside of the liposome is constituted Lucifer yellow(3-dihydro-1,3-dioxo-1H-benz(de) isoquinoline-5,8- disulfonate dilithium 6-amino-2-((hydrazinocarbonyl)amino)-2)</br>

（DNAをヘキスト染色。穴が開いていればLYが外に漏れだすはず ポジコンの実験プロトコルも書く</br>

筒で穴開いた写真）</br>

</br> </br> </p>

</div>


</div>

</body> </html>

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