Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Blueprint: Difference between revisions

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This image is an example.
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[[Image:Hayabusa-example.jpg]]
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This is the design of our DNA shell. We mimicked the structure of seashells that are capable of capturing preys.
For the purpose of measuring the strength of bonding or for some quantitative analysis, on domain A we attached florescent molecules, and on domain B, quenching molecules... A LOT. The more we have the florescent and quenching molecules, the larger the difference between in the florescence observed when the shell is “open” and “closed”.
The use of specific bonding of Streptavidin and biotin
As the model binding unit, we used the specific bonding of Streptavidin and biotin. Streptavidin is a protein that binds to 4 biotin molecules. Since their binding is very strong,
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いかに設計が大変だったか
いかに設計が大変だったか

Revision as of 07:03, 31 August 2012

<html> <head> <style> <!-- HIDE WIKI STUFF -->

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  5. column-content{width: 984px;background-color: #ffff;}
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<style>

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 display: block;

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 text-decoration: none;

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 text-align: center;
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 padding:6px;
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 width: 340px;
 padding: 0 0 0 12px;
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 text-decoration: none;
 font-size: large

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ul.submenu li a:hover { 

 color: black;
 text-decoration: underline;

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</style> </head> <body> 

 <!--<div style="text-align: right">
   <p><a href="http://openwetware.org/index.php?title=Template:Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo&action=edit">edit this header</a></p>
 </div>-->

 <div style="height: 60px; margin-bottom: 18px;">
   <div style="float: left; width: 250px; padding: 3px; background-color: white;">
     <a href="http://biomod.net/"><img src="http://openwetware.org/images/8/82/Biomod2012-logo.png" width="250px" height="50px"></img></a>
   </div>
   <div style="float: right; width: 240px; padding: 3px; background-color: white;">
     <a href="http://www.u-tokyo.ac.jp/en/" target="_blank"><img src="http://www.u-tokyo.ac.jp/en/images/banner/UT-logo.gif" width="234" height="60" border="0" alt="The University of Tokyo"></img></a>
   </div>
 </div>

   <div id="header">
   </div>

   <div id="menu">
     <ul class="menu">

<li class="toppage"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo">Top</a></li> <li class="motives"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Intro">Motives</a></li> <!-- <li class="design"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Function">Design</a></li> --> <li class="result"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly">Design & Results</a> <ul class="submenu"> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Assembly_of_the_DNA_Shell">Assembly of the DNA Shell</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Capturing_ability">Capturing Ability</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Immobilizing_on_microfluidic_device">Immobilizing on microfluidic device</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Supporting_Enzyme">Supporting Enzyme</a></li> </ul> </li> <li class="method"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Method">Method</a></li> <li class="futurework"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/FutureWork">Progress & Beyond</a></li> <li class="team"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Team">Team</a></li> <li class="acknowledgement"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Acknowledgement">Acknowledgement</a></li> 

     </ul>
   </div>

</body> </html>


Pictures

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This is the design of our DNA shell. We mimicked the structure of seashells that are capable of capturing preys. 



For the purpose of measuring the strength of bonding or for some quantitative analysis, on domain A we attached florescent molecules, and on domain B, quenching molecules... A LOT. The more we have the florescent and quenching molecules, the larger the difference between in the florescence observed when the shell is “open” and “closed”.



The use of specific bonding of Streptavidin and biotin

As the model binding unit, we used the specific bonding of Streptavidin and biotin. Streptavidin is a protein that binds to 4 biotin molecules. Since their binding is very strong,

いかに設計が大変だったか 配列設計 形状は貝殻の形にしました。このような形状にした理由は、目的の分子を効率よく捕まえ、かつ蛍光変化による検出感度をあげるためです。 今回作ったものは3つです ・何も付加しないshell ・蛍光分子と消光分子を取り付けたshell ・蛍光分子と消光分子及びビオチンを取り付けたshell

M13 mp3のsingle strandを本体のDNAorigamiに用いました。 本体の形状及び配列設計は、DNA配列設計ソフトであるCADnanoを用いました。 形状は以下のようになっております。 画像 （ここに本体の設計で大変だったこと）


このようにして作った本体に機能性を持たせるために、本体を形作る一部のstapleを延長させ、機能をもつ短いDNA断片と相補的に結合させる方法を用いました。具体的には、32塩基のstapleに対して、13塩基分の配列を追加しました。 今回は一方の面に12か所の蛍光分子と2か所の機能部位、もう一方の面に12か所の消光分子と、2か所の機能部位を取り付けるようにしました。設計した配列は、蛍光分子をくっつける配列、消光分子をくっつける配列、蛍光側の面に機能性部位を取り付ける配列、消光側の面に機能性部位を取り付ける配列の4つです。配置の方法は、それぞれの面の中心に機能性部位を取り付け、それを取り囲むように蛍光分子、あるいは消光分子を取りつけました。（図の黄色い配列が蛍光、消光分子を取り付けるために延長したstapleであり、赤い配列は機能性部位を取りつけるために延長したstapleを表しています）さらに、shellが閉じたときに、蛍光が消えるためには、とじた側の面ですべての蛍光分子と消光分子が向かいあう必要があり、そのためにはこれらの分子がそれぞれの貝殻の片方の面にのみくっつけることが要求され、大変でした。

一般に、適切なstapleの配列設計をするにあたって、設計した配列が目的の位置でのみハイブリをすることが要求されます。すなわち、目的の位置での結合エネルギーを小さくし他の場所の結合エネルギーを大きくすることが求められています。そのために以下のような工夫をした。

・設計する配列が、目的の部位以外で出現しないようにする ：ワトソンクリック塩基対（A-T,G-C）の結合が安定となるため、目的部位意外にハイブリする可能性がある塩基のsequenceがなければ、目的部位でのハイブリが一番安定となり、意図したハイブリが実現される可能性が高くなります ・目的のハイブリの融解温度を低くし、目的としないハイブリの融解温度を高くするように設計する ：計算ソフトにより試行錯誤的に試しました。ただし、完全にランダムに設計したわけではありません。経験的にstapleを構成する塩基のうちGCの含量が50%にすると、融解温度がいい感じになるそうです。 ・立体障害を起こさないようにする ：stapleから延長する配列と、機能性DNA断片とがすべてハイブリすると、本体と機能部位との間に立体障害が出てきます。この影響を緩和するために、延長する配列の根元部分にあえてハイブリを起こさない領域を作りました。具体的には、Tを2塩基分挿入しました。

これらのエネルギーに関する計算は、CADnanoでは出来ず、明確な設計解がないため、試行錯誤的な操作が必要となり、本当に大変な作業でした。エネルギーと融解温度の計算には、nupac及びdinameltという、ウエブ上の計算ソフトを用いました。 この計算には多大な人的労力を要しました。なぜなら、複数のstapleに同じ配列を延長する必要があるため、同じ配列を延長させたそれらのstapleが、すべて安定にハイブリする必要があり、そのような配列を探し出すのは、キャンパス内におとされた5セントコインを探し出すようなものでした。

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