Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Method: Difference between revisions

Revision as of 10:29, 19 October 2012

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 <!--<div style="text-align: right">
   <p><a href="http://openwetware.org/index.php?title=Template:Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo&action=edit">edit this header</a></p>
 </div>-->

 <div style="height: 60px; margin-bottom: 18px;">
   <div style="float: left; width: 250px; padding: 3px; background-color: white;">
     <a href="http://biomod.net/"><img src="http://openwetware.org/images/8/82/Biomod2012-logo.png" width="250px" height="50px"></img></a>
   </div>
   <div style="float: right; width: 240px; padding: 3px; background-color: white;">
     <a href="http://www.u-tokyo.ac.jp/en/" target="_blank"><img src="http://www.u-tokyo.ac.jp/en/images/banner/UT-logo.gif" width="234" height="60" border="0" alt="The University of Tokyo"></img></a>
   </div>
 </div>

   <div id="header">
   </div>

   <div id="menu">
     <ul class="menu">

<li class="toppage"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo">Top</a></li> <li class="motives"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Intro">Motives</a></li>  <li class="result"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly">Design & Results</a> <ul class="submenu"> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Assembly_of_the_DNA_Shell">Assembly of the DNA Shell</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Capturing_ability">Capturing Ability</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Immobilizing_on_microfluidic_device">Immobilizing on microfluidic device</a></li> <li><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Assembly#Supporting_Enzyme">Supporting Enzyme</a></li> </ul> </li> <li class="method"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Method">Method</a></li> <li class="futurework"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/FutureWork">Progress & Beyond</a></li> <li class="team"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Team">Team</a></li> <li class="acknowledgement"><a href="/wiki/Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Acknowledgement">Acknowledgement</a></li>

     </ul>
   </div>

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AFM

We used AFM (Atomic Force Microscopy) for observing shell shape which we made.

Principle

AFM is composed of cantilever, laser, photodiode, and detector and feedback electronics. AFM uses forces between the tip and sample. When cantilever approaches to sample, it deflected and this deflection is measured by laser. Reflected laser from cantilever is changed and its change is detected by photodiode and analyzed by feedback electronics

Scanning Mode

There are 3 kinds of scanning mode. In this project, we used trapping mode for getting shell images.

Trapping Mode

Move cantilever near to its resonance frequency, oscillate it up and down by piezoelectric. The amplitude of cantilever oscillation is decreased by interaction forces between cantilever and sample. Tapping mode lessens the damage to sample.

Static Mode

Cantilever drags the surface of sample. There are lots of noise and drift as dragging so low stiffness cantilevers are mainly used.

Non-contact Mode

Cantilever isn't contact with the sample. The distance between cantilever and sample is a few nanometers.

Photometer

Fluorophotometer F-2500形日立分光蛍光光度計具体的な実験操作方法

Absorption Spectrophotometer TMSPC-8 Tm Analysis System SHIMADZU CORPORATION GeneQuant Pro 具体的な実験操作方法

Electrophoresis

Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis

1.ガラス板の組み立て 1.1ガラス板2種類を持ってくる 1.2泳動を行う面にエチルアルコールをかけ、キムワイプで拭く 1.3コの字型のゴムカバーとクリップ4つを持ってくる 1.4ゴムを乗せ、クリップで自立できるように固定

2アクリルアミドゲルの作成 2.1ビーカーとコームを持ってくる 2.2ビーカーにアクリルアミドゲルを作る (10%の場合、超純水を8.12ml, 40%アクリルアミドを3.13ml, 10×TBEを1.25ml その後、10%APSを125μl, TEMDを8μl、の二つをあらかじめピペットに準備同時に入れ、すぐにビーカーを7秒くらい混ぜるアクリルアミドは神経毒なので注意) 2.3ガラス板を傾け、ゲルを流し入れる 2.4コームを差し込む、泡が立たないように2回 2.5ガラス板を傾けても水面が傾かないくらい、ドライヤーを3～4分間あてる 2.6 30分くらい待つ

3泳動装置の準備 3.1泳動槽を2種類持ってくる 3.2泳動槽の下側（下）にTBEバッファーを入れる 3.3ガラス板からコームを抜き、コの字型のゴムをはがす (クリップを一つはずす、ゴムをはがす、クリップを戻す、の繰り返し) 3.4クリップをはずし泳動槽の上側（上）に合わせ、クリップ2つで固定 3.5下に、泡が入らないように斜めに、上を差し込む (泡が入った場合は、注射器で取り除く) 3.6 上にTBEバッファーをいれる 3.7注射器でレーンを1往復掃除 3.8電極をさし、何も入れていない状態で200Vの電圧を30分くらい加える (通称プレラン、感電注意)

4,アプライ、泳動 4.1セロハンを一片切りとり、表面の保護紙をはがす 4.2セロハンの上に6×loading buffer(青)を1μlずつ20個配置 (作業が不安であれば10個配置して、アプライを繰り返す) 4.3サンプルを5μl取り、青の一滴と混ぜる 4.4混ぜた溶液を6μl取り、レーンに入れる 4.5 4.3から4.4をレーンの数だけ繰り返す 4.6電極をさし、200Vで30分くらい泳動する(感電注意)

5染色

5.1泳動槽を持って流しに移動 5.2バッファーを捨て、クリップを外し、ガラス板を取り外す 5.3ヘラでガラス板を分離する(この時ガラスを重ねないように注意)

5.4ゲルの表裏を示すため、スミを切っておく 5.5ビニール手袋をはめ、ヘラでゲルをガラス板からはがす 5.6サイバーゴールドの溶液に20分くらい浸す (サイバーゴールドは発がん性物質なので超注意)

6観測

6.1撮影装置の電源を入れ、可視光のスイッチをつける (UVのスイッチが切れていることも確認) 6.2手袋をしてヘラを使ってゲルを回収し、撮影装置の真ん中に乗せる 6.3装置の扉をしめ、可視光のスイッチを切り、UVのスイッチを入れる (紫外光に注意、特に波長254nmの紫外光を使う場合は保護メガネをする) 6.4となりの装置の時間を示すボタンを押し、露光時間を決定する 6.5 SAVEを押して画像がコンパクトフラッシュに保存する

7後片付け(みんなで使う装置なので、手を抜かない) 7.1クリップ、泳動槽、ゴム、コームは水で洗い、超純水でかける (クリップの閉じる部分、泳動槽のスミおよび配線、コームの隙間は念入りに) 7.2ビーカー、ガラス板は洗剤で洗い、最後に超純水をかける (特に注ぎ口、ガラスのスミは念入りに) 7.3撮影装置はまずゲルのカスをさらい、燃えるゴミへ 7.4撮影装置の内側にエチルアルコールをふきかけ、キムワイプで念入りに拭く 7.5コンパクトフラッシュのデータをPCにコピー

Agarose Gel Electrophoresis

作成中。誰か書いてくれたら助かります。

Thermal Cycler

Reagents

1.Google Docs 2.試薬 試薬の調整

File:Biomod-2012-UTokyo-UT-Hongo-

Biomod/2012/UTokyo/UT-Hongo/Method: Difference between revisions

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AFM

Photometer

Electrophoresis

Thermal Cycler

Reagents

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 =='''Electrophoresis'''==
 '''Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis'''
 .ガラス板の組み立て
 .1ガラス板2種類を持ってくる
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 .4撮影装置の内側にエチルアルコールをふきかけ、キムワイプで念入りに拭く
 .5コンパクトフラッシュのデータをPCにコピー
 '''Agarose Gel Electrophoresis'''
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