Biomod/2013/Sendai/design: Difference between revisions

Revision as of 08:37, 30 August 2013

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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</header> Design

  <section id="tabs">

<article data-title="Egg-type trigger">

<h3 id="designsubproject1">Egg-type trigger</h3>

<img src="http://openwetware.org/images/5/5a/Alginate-design-01.png" alt="example-tab2" border="0"> <div align="center">Fig1 内側からアルギン酸膜を破壊し、トリガーとなるDNAオリガミを放出するシステム

                   Fig1 process of Egg-type trigger</div><br>

We designed the following system to break membrane of algin acid from inner side.(Fig1) 1. We made chelate agent of dissolving algin acid (EGTA),urea and liposome containing nipam and enclosing DNA strand and DNA origami, which can be triggers of breaking liposome lying outer the membrane of algin acid. nipam is hydrophile in the state of less than 32℃. However, in the state of more than 32℃, nipam constrict and become hydrophoby. Liposome modified by nipam is stable in the state of less than 32℃ due to hydration of nipam molecular, though it is unstable in the state of more than 32℃ because of hydrophoby of nipam molecular. So liposome will be bloken when the temperature of liposome is more than 32℃. We consult following URL. http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf 2. When the temperature of liposome is more than 32℃, it will be break down. 3. When liposome is broken, chelating agent enclosed in liposome broke down membrane of algin acid and urea solution is diluted. After that, DNA is annealed and formed DNA origami. 4. From broken membrane of algin acid, DNA origami fall out. These system enable us to emit trigger on us own time when we increase heat at 37℃.

内側からアルギン酸膜を破壊するために私たちは以下のようなシステムをデザインしました。（Fig1の数字と下記の説明の説明は対応している） ①内部にアルギン酸を溶かすキレート剤（ＥＧＴＡ）と尿素とトリガー（アルギン酸膜外にあるリポソームを割ることができるもの）となるＤＮＡオリガミ/ＤＮＡストランドを入れたニッパム分子付きのリポソームを作製します。ニッパムとは３２度以下では水和していて親水性だが、３２度以上では収縮して疎水性になる。ニッパムがリポソームに修飾されると、３２度以下ではニッパム分子の水和により安定な状態になるが、３２度以上ではニッパム分子が疎水性になって不安定な状態になるので、３２度以上になった時にリポソームが割れることになる。 参考 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf ②温度を約３２度に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊されます。 ③リポソームが破壊されたことで内部のキレート剤がアルギン酸膜を破壊し、それと同時に尿素が希釈されることでＤＮＡがハイブリタイゼーションしてトリガーとなるＤＮＡオリガミが形成されます。 ④破壊されたアルギン酸膜からトリガーのＤＮＡオリガミが外に出ていきます。 このようなシステムの設計によって、好きな時に温度を３７度に上げればトリガーを放出することが可能になります。 </article>

<article data-title="Chain-reactive burst">

<h3>Chain-reactive burst</h3>

We designed chain-reactive burst systems as follows.Each liposome contains triggers, drugs, and has receptors of the trigger. When liposomes are destroyed, new triggers and drugs are released.To achieve liposome's burst by outside trigger, following two approaches are raised. リポソームが連鎖的に割れるようなシステムをデザインしました。リポソーム内部のtriggerは、リポソームが割れると放出され、周囲のリポソームを割ります。リポソームに外部からの負荷をかけて割ることを目的に、以下の2つのアプローチを考案しました。

<li>i)膜を湾曲させるアプローチ <h5>i)A bending approach</h5></li> <li>ii)フラワーミセルによるアプローチ<h5>ii)A flower micelle approach</h5></li> At first, we considered a theory to disrupt liposomes by a trigger DNA signal. About the change of vesicles by destroyed, estimated the difference of free energies of vesicles by calculations about free energies of different kinds of size. And also discuss what kind of size that vesicles are more stable.

Please see the details below link (Go to Calcultion pageリンクを張る). このリポソームを割るときの理論的アプローチについて考察しました。ベシクルが壊れる変化について、大きさの違いによる自由エネルギーの値から、どのような大きさのときにより安定で、どのくらいのエネルギー差があるのかを計算により見積もった。詳細はCalculationのページへ。（リンクを張る）

<h4>i)膜を湾曲させるアプローチ i)A bending approach</h4>

<Img Src="http://openwetware.org/images/d/d2/Bending-flow.png" Align="center" width="900px" > <div align="center">Fig2 process of bending membranes</div>

1.リポソーム表面にccDNAを付着させる。 Cholesterol modified DNA strands attaches surface of liposomes. 2.相補的DNA鎖付きのDNAオリガミを加える。 Then, DNA origami with complementaly strand are added as triggers. 3．表面にbindしたオリガミ構造体によって膜表面に負荷がかかる。(詳細は後述)

  Triggers bind surface of liposomes and get a load on membrane.<br>

4．負荷によって膜がburstする。

  By the load of trigger, liposome was destroyed.<br>

<h5>Mechanism of bending membranes</h5>

リポソームを割るため、私たちは生物が膜を湾曲させるメカニズムに着目した。膜の湾曲、すなわち不安定化を最大限に利用することが出来れば、膜の崩壊につながると考えたからである。膜を湾曲させるメカニズムには、以下の三つが提案されている。 To break liposomes, we focused on the mechanism the living things use to bend cell membranes. We consider that if we could make use of the mechanism of bending membranes (destabilizing membranes), it would lead to the collapse of membranes. The following three mechanisms have been proposed as of now (<A Href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19780639">Membrane-bending proteins</A>)

<Img Src="http://openwetware.org/images/a/ae/Designfig2.png" Align="left" width="280px" height="400px">

Aは、両親媒性基をもつ分子が細胞膜に挿入されることにより、膜が湾曲するというものである。脂質二重膜の内側の強い疎水性部分は、脂質両膜をくっつけて離さない性質をもっている。このため、両親媒性基が片方の膜内に入りこみ、その膜が広がると、もう片方の膜は、少ない表面積でも済むように、内側になるようつられて曲がる。 Bは、膜表面に付着した分子が固い足場となり、下の膜を変形したり、あらかじめ湾曲されていた膜を固定化(stabilize)するというものである。 Cは、片方の膜に脂質を群がらせることにより、脂質の量が両膜で不均等になることにより、膜が湾曲するというものである。 生体膜を湾曲させるタンパク質のほとんどは、A~Cのメカニズムを組み合わせて使っている。 また、近年、タンパク質同士が密集することで、膜が湾曲されるという考えも提唱されている(Membrane bending by protein-protein crowding). これは、膜結合タンパク質同士の衝突による、横方向の圧力により、膜が曲がるというものである。 The mechanism A is that amphipathic molecules are inserted into the cell membrane and the bending is caused. The inner hydrophobic part of the lipid bilayer has a strong adhesive power for the two leaflets. Thus, once the amphipathic molecules are inserted into one leaflet of the membrane and expand it, the other leaflet bends according to it, making its surface area smallest. The mechanism B is that the molecule attached to the membrane becomes a rigid scaffold and distort the membrane under itself, or stabilize the already bended membrane. The mechanism C is that lipid molecules are clustered in one leaflet of the membrane and the inequality of lipid quantity makes the membrane bend. Most membrane bending proteins combine the above three mechanisms. In addition, a theory that protein crowding causes the bending of cell membranes ( <A Href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22902598">Membrane bending by protein- protein crowding</A>) has recently been suggested. This mechanism is that the collision of membrane proteins produces lateral pressure on membranes and distorts them. 以上から、膜を不安定にさせるためには、 <ur><li>・固い足場となる</li> <li>・足場の影響を最大にするため、表面積が大きい</li> <li>・衝突により大きな圧力が生じる</li> 構造が有効であると考えられる。 Due to the above reasons, the efficient design for destabilizing membranes is the structures that : <ur><li>have rigid scaffolds</li> <li>have large surface areas to maximize the effect of the scaffold on the membrane</li> <li>produce a large pressure by collisions</li></ur> 私たちは、固い足場となる分子を実現するために、DNAオリガミに着目した。DNAオリガミは任意の形に固い構造を作ることができるからである。そして、表面積の大きい構造として、平面構造を、 To make rigid scaffolds, we took note of DNA origami, because DNA origami is a method for making rigid structures of any shape. Moreover, we adopted a 2D structure to make the surface area largest.

<!-- <Img Src="http://openwetware.org/images/f/f9/Lipo2.png" Align="left">

-->

衝突により横方向に最大の圧力が生ずるような構造として、長方形や三角形を考えた。 We also designed rectangle and triangle to make the pressure of the collision highest. <Img Src="http://openwetware.org/images/6/63/Outsidefig3.png" Align="left">

長方形はそれ自体で一つの足場として働き、三角形(球面をもっとも効率よく覆う図形)は沢山集合して一つの固い足場を作ればもっとも効率が良いと考えられる。 We suppose that rectangle and triangle structures are most effective for the following reasons. Rectangle is expected to work as one scaffold in itself; triangle (the most efficient figure that covers a sphere) structures, to gather and work as one big rigid scaffold. 長方形オリガミの設計は以下の様である。 The design of our rectangular DNA origami is as below. <Img Src="http://openwetware.org/images/6/6e/Outsidefig4.png" Align="left">

<Img Src="http://openwetware.org/images/a/a7/Lipo5.png" Align="right">

DNAオリガミは、縦67.6nm(26らせん)、横127nm(374塩基)の、長方形である。AFMでの観察時に裏表の区別が付けられるよう、右上で縦10らせん、横161塩基の長方形を切り取った形とした。設計はcaDNAno2で行った。 さらに、膜が不安定になるよう、このオリガミの中心部分のステイプル141本を、コレステロール付きDNAと結合させ(両親媒性基をもたせ)、膜に突き刺すことが出来るようにした。 つまり、このコレステロール修飾DNAは、リポソームと足場をつなぐ役割をするだけでなく、膜に突き刺さり、膜を不安定化する両親媒性分子としても働く。 We used caDNAno for our DNA origami design. The DNA origami has a rectangle shape of 67.6nm (26 helixes) by 127 nm (374 bases). We cut out a smaller rectangle of 10 helixes by 161 bases at one edge of this origami, so that we could distinguish the two sides during AFM (Atomic Force Microscope) observation. Besides, to destabilize the membrane by inserting this origami, we designed 141 staples at the center of the origami to hybridize with cc DNAs (in the rest of this document, referred to as ccDNA. It gives our origami amphipathicity) and enabled it to insert into the membrane. To sum up, the cc DNA not only connects DNA origami and liposomes but also inserts into the membrane and destabilizes it.

<h5>ⅡフラワーミセルによるアプローチⅡUtilizing flower micelles</h5> <Img Src="http://openwetware.org/images/1/17/Designflowerflow.png" Align="center" width="900px" > <div align="center">Fig2 process of flower miceles burst</div>

<Img Src="http://openwetware.org/images/b/b2/Flower1.png" style="height:300px; width:425px; float:right;"> リポソームを割るには、フラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るというものである。 There is a method called flower micelles for breaking liposomes. In this method, we cover the surface of the micelles with many copolymer rings, heat and distort the rings, and produce pressure on the micelle and break them.

今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。 We tried to break liposomes by applying the basis of flower micelles.

リポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドと、これに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているため、リポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。 First, we mixed cc DNAs, loop strands, and liposomes. The loop strand is designed to have two complementary parts to the cc DNAs at its both ends. So when it binds to the cc DNAs, it is expected to make a loop between its both ends. The complex of the cc DNAs and loop strand floats on the surface of the liposomes. <Img Src="http://openwetware.org/images/a/aa/Flower2.png"> 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAがハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。 Next, we added complementary trigger strand to the loop strand. The trigger strand hybridizes with the loop strand first, and then keeps straight, because we designed the trigger strand shorter than persistence length. <img src="http://openwetware.org/images/0/03/Flower3.png"> その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。 This process gives pressure on the liposome and breaks them. <Img Src="http://openwetware.org/images/3/3b/Flower4.png"> リポソーム内部の溶液中にトリガーを入れておくことができるので、Ⅰ・Ⅱを使って、外側からリポソームを破壊し連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。 We consider if some triggers are kept inside the liposomes and the liposomal membrane is broken by the above Ⅰ and Ⅱ methods from the outside, it would be much easy to begin the chain reaction. このシステムで使用するDNAの配列はDNAdesignを使って設計しました。 プログラムのソースはこちら。ループの部分が40nt, 20nt,10ntのDNAを設計しました。 赤色の部分がリポソームから生えているコレステロール付きのDNAと相補になっています。青色の部分が相補的になっていてこれらがハイブリタイゼーションすることでリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れます。 We designed the DNA sequence for this approach by <A Href="http://www.dna.caltech.edu/DNAdesign/">DNA design</A>, software for designing DNA sequences. We arranged three kinds of DNA strands that hybridize with the surface of liposomes via cc DNA. Each has 40nt, 20nt, and 10nt loop parts (shown below as blue parts). The blue parts are complementary to the blue trigger strands, and when they hybridize, they place some stress on the liposome and break it.

The red parts are for hybridizing with liposomes. They are complementary to the cc DNA on the surface of liposomes. The cc DNA is the same as that used in Ⅰ Approach by bending membrane (see <A Href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai/protocol">Protocol</A>). <br>

The sequence of cholesterol-conjugated DNA CCAGAAGACG -cholesterol A loop is 40nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTGCGAACCACGGTTCCCAGCGTGACCTTCATGCTTAAGTTTCGTCTTCTGG trigger Strand of coping in loop 40nt AAACTTAAGCATGAAGGTCACGCTGGGAACCGTGGTTCGC A loop is 20nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTTTCATAACATGAGGCGCCGTCGTCTTCTGG trigger Strand of coping in loop 20nt ACGGCGCCTCATGTTATGAA A loop is 10nt CGTCTTCTGGTTTTTTTTTTCTGTAACTAACGTCTTCTGG trigger Strand of coping in loop 10nt TTAGTTACAG

       </article>

<!--

       <article data-title="B-Z">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4>

まずリポソームを割る方法としてフラワーミセルという方法がある。これはミセルに隙間なくコポリマーによる輪を取り付け、その輪の温度による形状の変化によりミセルに負荷をかけ、割るとゆうものである。

今回はこのフラワーミセルの原理を応用しリポソームとＤＮＡによってリポソームを割ることを試みる。 リポソームはDOPCで作った通常のものとDOPC、DPPC、cholesterolの三種類を混ぜ、相分離を形成しているものの二種類を用いる。 これはリポソーム表面の状態の違いによる収率の違いを調査するためである。 これらのリポソームにコレステロール修飾されているDNA一本鎖ストランドを加えて、表面にDNAを生やす。 そこに先程修飾したDNAに相補なDNA一本鎖ストランドを加える。このＤＮＡは両端が相補に結合するように設計されているためリポソーム表面でDNAのループが形成されるようになる。 次にループを形成しているDNAに相補なトリガーストランドを加える。これとループDNAハイブリタイゼーションし結合する。この際DNAが持続長以下の長さに設計してあるため、DNAはまっすぐに保とうとする。その際に生じる力でリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れるはずである。

リポソーム内部の溶液中にトリガーストランドを入れておくことができるので、この系であれば連鎖反応を引き起こすことも容易であると考えられる。

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Biomod/2013/Sendai/design: Difference between revisions

Revision as of 08:37, 30 August 2013

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 ．負荷によって膜がburstする。
     By the load of trigger, liposome was destroyed.<br>
+<br>
+<h5>Mechanism of bending membranes</h5>