Biomod/2013/Sendai/protocol: Difference between revisions

Revision as of 22:30, 28 August 2013

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/* Typography */

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/* Tabs */

tabs

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header nav a{ padding:.7em .8em } header nav{ float: none; margin: -.5em -3em 0; background: #000; overflow: hidden; text-align: left } header nav a{ border-right: 1px solid #222 } [role=main]{ padding:1.5em 2em; } header nav div{ display: none; }

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/*column content*/

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/*****キャプションレフト*****/

div.caption-left{ float: left; padding: 0 5px 5px 5px; }

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/*****キャプションライト*****/

div.caption-right{ float: right; padding: 0 5px 5px 5px; }

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/***floatの影響を絶つ。<div class="c-both"></div> のように使う***/

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div.title{

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div.caption{

       text-align: center;
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div.captiontable{

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       font-weight: bold;

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/*topに戻る*/

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/* IE6以下用、アスタリスクハックでググれ */

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ttop:hover {background:url(http://openwetware.org/images/b/b9/Top2.png) no-repeat left bottom;/* 画像の高さによって適当に調整 */

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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</head>

   <header>

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           <a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai" class="whiteSendai">Top</a> 
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<a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013" class="whiteSendai" style="float:right;"><img src="http://openwetware.org/images/6/6e/Biomod-logo.jpg"

                                              width="75" height="75" alt="Biomod2013" border="0"></a><br>
           <a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai/protocol" class="whiteSendai">Protocol</a>   
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            <a href="http://openwetware.org/wiki/Biomod/2013/Sendai"><h1 style="color:white;" ><b>Biomod<span>2013<br>&emsp; Team</span>Sendai</b></h1></a>

   </header>

   <section id="tabs">

<!--

     <article data-title="Protocol">

           <h2>Protocol</h2>

<p> <h3>About</h3></br>

<a href="#experimentsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</a><br> <a href="#experimentsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </a><br> <a href="#experimentsubproject3">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">B-Z班</font> </a><br>

    </article>

-->

     <article data-title="アルギン酸">

<h3 id="experimentsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3></br>

<h4>1-1リポソームの作製とそれをバッファーに入れてアルギン酸ゲルビーズ内に入れる実験</h4></br>

グルコース100μℓにoil70μℓを加えてouterバッファーを作製した。次に、oil40μℓにBSG（？）（蛍光物質）を1μℓ加えて、ピペッティングとタッピングで白く濁るまで混ぜて、innerバッファーを作製した。そのinnerバッファーをouterバッファーの上に注いで70秒遠心にかけて、リポソームを作製した。</br> 遠心した後、チューブの底にたまったベシクルを取り出し、1.5% アルギン酸ナトリウムに加え、それをキャピラリー中に入れ、400mM 塩化カルシウム 140μL中に滴下してFig1のような装置で２～３分遠心した。</br>

    Fig1 アルギン酸ゲルビーズの作製</br></br>

<h4>1-2内部にバッファーの入ったアルギン酸膜の作製</h4></br>

Fig3のように外側の太いキャピラリーと内側の細いキャピラリーを作成する。キャピラリーは外径1mmのものを熱加工した。</br> </br> 外管には1.5%アルギン酸ナトリウム溶液を、内管には蛍光物質+mQをいれた</br>

２重キャピラリーを用いて2～3分遠心にかけ0.4M塩化カルシウム水溶液に滴下する。</br>

    Fig3 二重ノズルの構造</br></br>

<h4>2ニッパムの効果でリポソームが割れることの確認実験</h4></br>

ニッパム分子は３２度以下では水和していて親水性だが、３２度以上では収縮して疎水性になる。ニッパムがリポソームに修飾されると、３２度以下ではニッパム分子の水和により安定な状態になるが、３２度以上ではニッパム分子が疎水性になって不安定な状態になるので、３２度以上になった時にリポソームが割れることになる。</br>

参考</br> http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipedds2.Par.0001.File.tmp/j_recipedds2.pdf</br></br>

まず、PNIPAMに脂質を修飾する。まず、PNIPAMにCHCl3とAr存在下でジシクロヘキシルカーボジイミド（DCC）と、Ｎ-ヒドロキシ-シアナミド（NHS）を反応させる。（下図の１ができる）次に、CHCl3とAr存在下でジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（dimyristoylphosphatidylethanolamine、DMPE）を反応させる。（下図の２ができる）このようにしてPNIPAMに脂質を修飾して、GUVによりニッパム修飾されたリポソームを作製した。</br></br>

    Fig4 PNIPAMへの脂質の修飾</br></br>

※W/Oエマルション法を用いたGUV(Giant Unilamellar Vesicle)によるリポソームの作製</br></br>

10mM DOPCのストック溶液をArガスで乾燥させた脂質フィルムをミクロチューブ内に作り真空デシケータ内でさらに乾燥させた。リン脂質フィルムに流動パラフィン 500μLを加える。超音波洗浄機を用いて60℃で60分間リン脂質をオイルに溶かした。インナー溶液を150mM スクロース、350mM グルコース、100mM EGTAとする。オイルに溶かしたリン脂質にインナー溶液 50μLを加え、遠心分離し、エマルション溶液を作製した。アウター溶液を600mM グルコースとする。アウター溶液 100μLにエマルション溶液 70μLを加える。</br></br>

参考</br> Thermoresponsive Nanostructures by Self-Assembly of a Poly(N-isopropylacrylamide)−Lipid Conjugate Daniel N. T. Hay ,† Paul G. Rickert ,‡ Sönke Seifert ,§ and Millicent A. Firestone *† J. Am. Chem. Soc., 2004, 126 (8), pp 2290–229　Publication Date (Web): February 3, 2004</br></br>

<h4>3アルギン酸ゲルビーズを溶かすのに必要なＥＧＴＡの濃度と時間の測定</h4></br>

<h4>4尿素アニーリングによるＤＮＡオリガミの作製とその作製にかかる時間の測定</h4></br>

M13pm18(7249nt)と226個のステプルを100μℓの12.5mMの酢酸マグネシウム入りの10×TAEの中に入れ、95℃から20℃に１℃/分でアニーリングしたものとM13pm18と226個のステイプルを300μℓの12.5ｍMの酢酸マグネシウムと85%のホルムアルデヒド入りの10×TAEの中に入れ、透析装置で0.2mℓ/分の割合で次第にホルムアルデヒドの濃度を薄くしていったものとをAFMや電気泳動で調べた。</br>

<h4>5温度を上げればアルギン酸膜が破壊されることの確認</h4></br>

<h4>6アルギン酸膜内で尿素アニーリングができていることの確認</h4></br>

<h4>7全体のシステムの機能確認</h4></br>

     </article>

     <article data-title="リポソーム">

<h3 id="experimentsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </h3> <h3>Making liposomes</h3> <ur><li>1． <table border cellspacing="0" bgcolor="lightyellow"> <tr bgcolor="moccasin"> <td>10nM DOPC</td> <td>4µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>1µl TR-DHPE</td> <td>4µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>CHCl3</td> <td>92µl</td> </tr> </table> 以上をミクロチューブにいれアルミホイルでミクロチューブ覆いArガスで乾かした。</li> <li>2．次に、ミクロチューブに100μℓ観察用Bufferを入れ、３時間ほど湯煎した。</li> <li>3．箱からミクロチューブを取り出しそこから30μℓとり蛍光顕微鏡で観察した。</li></ur> <br>

<h3>コレステロール修飾リポソームの作成</h3> <ur><li>1.<table border cellspacing="0" bgcolor="lightyellow"> <tr bgcolor="moccasin"> <td>10nM DOPC</td> <td>1µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>CHCl3</td> <td>99µl</td> </tr> </table></li> <li>2.次に、この溶液をArガスで乾かし、真空乾燥機に1晩おいた。</li> <li>3.１晩おいたミクロチューブに１×TAE　Mg2+を100μℓ入れ、整置水和でさらに１晩おいた。</li> <li>4.リポソームにコレステロール修飾したDNAをつけるため、作製したリポソーム(0.1mM)　0.5μℓをとり、cholesterol leg(0.1μM)　0.2μℓを加えた。</li></ur> (上手く観察できなかったので、お盆明けに再度実験します)<br>

<h3>Annealing solution</h3> <table border cellspacing="0" bgcolor="lightyellow"> <tr bgcolor="moccasin"> <td>84nM M13mp18</td> <td>2.38µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>Staples</td> <td></td> </tr> <tr> <td>1µM migihaji</td> <td>1µl</td> </tr> <tr> <td>1µM hidarihaji</td> <td>1µl</td> </tr> <tr> <td>1µM ashibatemae</td> <td>1µl</td> </tr> <tr> <td>200nM ashiba</td> <td>5µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>1µM cholesterol-hybridizing ssDNA</td> <td>3µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>1µM fluorescent-tagged DNA-hybridizing ssDNA</td> <td>3µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>5xTAE Mg2+</td> <td>10µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>mQ</td> <td>20.62µl</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>1µM fluorescent-tagged DNA</td> <td>3µM</td> </tr> </table>

アニーリングをfrom 95℃ to 25℃ at 1℃ per 2 minutesで行った。<br> <br> 対照実験として、蛍光基付きDNAの代わりに、mQ 3µlを使用した、蛍光修飾なしDNAオリガミも作成した。 <br>

<h3>1% Agarose gel</h3> <table border cellspacing="0" bgcolor="lightyellow"> <tr bgcolor="moccasin"> <td>agarose </td> <td>0.4g</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>50xTAE</td> <td>0.8ml</td> </tr> <tr bgcolor="moccasin"> <td>mQ</td> <td>39.2ml</td> </tr> </table> １%アガロースゲルを、bufferとして1×TAE溶液を加えた電気泳動槽にセットし、各ウェルに6μlずつサンプルを流して(ただし、ラダーは3µl)、CV100Vで50分電気泳動を行った。<br>

       </article>

       <article data-title="B-Z">

<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3><br> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4><br>

      </article>

   </section>

   <footer>
       <p>&copy; Copyright Biomod 2013 Team Sendai
               <a href="http://www.molbot.mech.tohoku.ac.jp/index.html">

　　　　　　　　　　　　　　　　　　<img src="http://openwetware.org/images/3/36/Murata-nomura-logo.png"

                                     width="180" height="50" alt="Molcular Robotics Lab" border="0" align="right">

　　　　　　　　 </a> 　　　　 </p>

       <p>E-MAIL:
           <a href="mailto:biomod.teamsendai.2012@gmail.com">biomod.teamsendai.2012@gmail.com
           </a>
       </p>
       <br>
       <a href="?action=edit" align="center"><p>edit</p></a>
   </footer>

</body> </html>

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