Biomod/2013/Sendai/sandbox2: Difference between revisions

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脂質(DOPC)、脂質を溶かす溶媒(CHCl3)、TR-DHPEをミクロチューブにいれ、Arガスで乾かした。次に、観察用Bufferを加えたのち、湯煎してリポソームを作成した。リポソームは蛍光顕微鏡で観察した。</br>
脂質(DOPC)、脂質を溶かす溶媒(CHCl3)、TR-DHPEをミクロチューブにいれ、Arガスで乾かした。次に、観察用Bufferを加えたのち、湯煎してリポソームを作成した。リポソームは蛍光顕微鏡で観察した。</br>
</br>
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[[Image:Example.jpg]]
<Img Src="http://openwetware.org/images/c/cf/Fig1_liposome.png">
<Img Src="http://openwetware.org/images/1/1c/Fig2_liposome.png"></br>
Fig.1,2 separated, uni-lamella liposomes observed by a fluorescent microscopy</br>
Fig.1,2 separated, uni-lamella liposomes observed by a fluorescent microscopy</br>
蛍光顕微鏡で、数個の(or多量の?)リポソームが観察された(Fig.1,2)。リポソームは、赤く膜のみが染色されており、個々に分かれたユニラメラリポソームが作成できた。</br>
蛍光顕微鏡で、数個のリポソームが観察された(Fig.1,2)。リポソームは、赤く膜のみが染色されており、個々に分かれたユニラメラリポソームが作成できた。</br>
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</p>


Revision as of 01:50, 17 August 2013

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   <title>Biomod2013 Sendai ver2.0</title>
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   <section id="tabs">
       <article data-title="Project">

<h2>Abstract</h2><p>DDSは薬剤を運ぶ有効なアプローチであるが、制御された薬の放出系が必要である。<br> 私たちのプロジェクトは、構造や論理回路の設計が可能であるDNAを利用して、トリガーを元にした連鎖反応により制御された薬剤放出系を実現することである。トリガーDNAのリポソーム表面へのハイブリダイゼーション、物理的な負荷がかかることにより、リポソームを破壊する。リポソームは有効成分と、新たなトリガーを含んでおり、放出された構造物は、連鎖反応的に周囲のリポソームを破壊する。</br> 反応を開始するトリガーDNAはリポソーム・アルギン酸二重膜に閉じ込められている。リポソーム表面には、ニッパム分子が修飾されており、37℃程度に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊される。リポソーム内部に含まれるキレート剤の効果により、アルギン酸膜も破壊され、37℃条件下で両膜が破壊されると、トリガーのＤＮＡオリガミが外に出ていく。</br> リポソーム表面はトリガーDNA構造体の一部と相補的な配列を持つ一本鎖DNAを多数含んでおり、トリガーDNAはリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションする。トリガーDNAのリポソーム表面への付着及びリポソームの破壊を顕微鏡で確かめ、リポソームの破壊を確認した(予定)。</br> このようなシステムの設計により、好きな時に温度を37度に上げればトリガーの放出及び有効成分の放出が可能になる。</p> 

           <h2>Project</h2>

            <p><h3>Background</h3>

近年、ゲノミクス・プロテオミクス研究によりsiRNAなどの新しい薬が生み出されているが、それらの成否を握るのは、<a href="http://www.dojindo.co.jp/letterj/119/news119.pdf">生体へのデリバリー技術</a>である。DDSはこれに有効なアプローチである。DDSにはリポソームやポリマーが利用され、これらは薬の薬学的・治療の有効性を上げることに寄与しうる。</br> Recently genomics and proteomics have well studied, and new drugs such as siRNA are created. </p> <p><h3>Motivation</h3> DDSでは、過剰に薬剤が投与されてしまうと、組織に損害を与えてしまう。そこで、制御された薬の放出系が必要となる(<a href="http://www.sciencemag.org/content/303/5665/1818.short">Drug delivery systems: entering the mainstream</a>)。</br> 生体分子のうち、人の手で自在にプログラムから生成を行える分子はDNAである。DNAは反応経路を正確にプログラムでき、論理計算も行えるので(何か論文リンク貼る)、 私たちは運び屋としてリポソームを、制御分子としてDNAを用いて、制御された薬剤放出系を実現しようと考えた。 </p> <p><h3>Method</h3> 薬の運び屋であるリポソームを、DNAをトリガーとして割る。割ったらリポソームの内容物が放出される。リポソームは有効成分と、DNA構造物を含んでいる。内部に含まれるDNA構造体を、トリガーと同じ構造にすれば、出てきた構造物は、新たなトリガーとなり、再び周囲のリポソームを破壊する。こうして、次々とリポソームの内容物が連鎖的に放出される。</br> <h4>・The beginning of interaction</h4> 反応を開始するトリガーDNAはリポソーム・アルギン酸二重膜に閉じ込められている。また、リポソーム内部にはキレート剤、ステイプル、M13,尿素が含まれており、高濃度の尿素により、ステイプルとM13は別個に(DNAオリガミ構造体を作らずに)存在している。</br> リポソーム表面には、ニッパム分子が修飾されており、37℃程度に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊される。次に、リポソーム内部に含まれていたキレート剤の効果により、アルギン酸膜が破壊される。37℃条件下で両膜が破壊されると、尿素濃度が低下し、ステイプルとM13からDNAオリガミ構造体が生成され、トリガーとして外に出ていく。</br> <h4>・The chain reaction</h4> リポソームをDNAをトリガーとして割るには、まず、リポソームにコレステロール修飾DNAを添加し、表面に一本鎖DNAが現れるようにする。これを、トリガーDNA構造体の一部と相補的な配列を持つ一本鎖DNAとすれば、トリガーDNAはリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションすることになる。</br> 一本鎖DNA付きリポソームの生成後、相補的な配列をもつトリガーDNA構造物を加える。トリガーDNAがリポソーム表面に付着すると、その物理的な特性により、リポソームが破壊される(影山先輩の数式へリンク貼る。込み入った数式を用いた説明はそこでする)。</br> </br> リポソームは有効成分と、新たなトリガーを含んでおり、放出された構造物は、連鎖反応的に周囲のリポソームを破壊する。</br> </p> <p><h3>Project goal</h3></br> 2013年の夏、私たちは以下のプロジェクトゴールを実現させる：</br> </br> <ur> <li>1．破壊するリポソームの作成</li> <li>2．リポソームにDNA構造体を作用させる</li> <li>3．リポソームを割る</li> </ur> </br> トリガーとして構造や論理回路の設計が可能であるDNAを利用することから、トリガーを元にした連鎖反応により制御された薬剤放出系を実現することができる。これはDDSの薬剤的・治療的効果を高めることに寄与するであろう。</p> 

               <img src="http://openwetware.org/images/6/6e/Biomod-logo.jpg" width="75" height="75" align="right" alt="example-tab1" border="0">
            </p>
           
           <a href="#" onclick="myTabs.next(); return false">Finished ? Go to the next tab</a>
       </article>


　　　　 <article data-title="Design"> 

           <h2>Design</h2>

<p> <h3>全体のプロジェクト</h3></br> がん細胞と戦うために私たちは膜構造を破壊してその反応が連鎖していく次のようなシステムを考えました。</br> まず、内部にトリガーが入っているアルギン酸膜とリポソームを作ります。次に、アルギン酸膜が内側から破壊されてトリガーが放出され反応が開始します。このトリガーがリポソーム膜を外側から破壊してさらにトリガーが放出されて、反応が連鎖していくというシステムです。</br> 私たちは「内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト」と「外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト」の二つのサブプロジェクトを実行してこのシステムの完成を目指しました。</br></br>


<a href="#designsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</a><br> <a href="#designsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </a><br> <a href="#designsubproject3">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">B-Z班</font> </a>


<h3 id="designsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3></br>

内側からアルギン酸膜を破壊するために私たちは以下のようなシステムをデザインしました。</br> ①内部にアルギン酸を溶かすキレート剤（ＥＧＴＡ）と尿素とトリガーとなるＤＮＡオリガミ/ＤＮＡストランドを入れたニッパム分子付きのリポソームを作製します。</br> ②温度を３７度程に上げることで、ニッパム分子が収縮しリポソームが破壊されます。</br> ③リポソームが破壊されたことで内部のキレート剤がアルギン酸膜を破壊し、それと同時に尿素が希釈されることでＤＮＡがハイブリタイゼーションしてトリガーとなるＤＮＡオリガミが形成されます。</br> ④破壊されたアルギン酸膜からトリガーのＤＮＡオリガミが外に出ていきます。</br> このようなシステムの設計によって、好きな時に温度を３７度に上げればトリガーを放出することが可能になります。</br></br>

<img src="http://openwetware.org/images/c/c4/Kari-design-alginate.jpg" 

                                              align="left" alt="example-tab2" border="0"></br>


<h3>外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト</h3></br> <h4 id="designsubproject2">リポソーム班</h4></br> <h4 id="designsubproject3">ＢＺ班</h4></br> このシステムで使用するDNAの配列はDNAdesignを使って設計しました。</br> プログラムのソースはこちら。ループの部分が40nt, 20nt,10ntのDNAを設計しました。</br> 赤色の部分がリポソームから生えているコレステロール付きのDNAと相補になっています。青色の部分が相補的になっていてこれらがハイブリタイゼーションすることでリポソームに負荷がかかり、リポソームが割れます。</br>

<font size="-2"> コレステロール付きDNAの配列</br> <font color="red">CCAGAAGACG</font> -コレステロール</br> ループが40nt</br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTT<font color="blue">GCGAACCACGGTTCCCAGCGTGACCTTCATGCTTAAGTTT</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font></br> ループが40ntのトリガーストランド</br> <font color="blue">AAACTTAAGCATGAAGGTCACGCTGGGAACCGTGGTTCGC</font></br> ループが20nt</br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTTTT<font color="blue">CATAACATGAGGCGCCGT</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font></br> ループが20ntのトリガーストランド</br> <font color="blue">ACGGCGCCTCATGTTATGAA</font></br> ループが10nt</br> <font color="red">CGTCTTCTGG</font>TTTTTTTTTT<font color="blue">CTGTAACTAA</font><font color="red">CGTCTTCTGG</font></br> ループが10ntのトリガーストランド</br> <font color="blue">TTAGTTACAG</font></br>

<img src="http://openwetware.org/images/e/ec/Kari-design-bz.jpg">

</font>


</p> 

           <a href="#tabexperiment" onclick="myTabs.next(); return false">Go to next tab</a>
       </article>






       <article data-title="Experiment">

           <h2 id="tabexperiment">Experiment</h2>

<a href="#experimentsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</a><br> <a href="#experimentsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </a><br> <a href="#experimentsubproject3">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">B-Z班</font> </a><br> 

           <p>

<h3 id="experimentsubproject1">内側からアルギン酸膜を破壊するサブプロジェクト</h3></br> <h4>アルギン酸膜の作製</h4> W/Oエマルション法を用いたGUV(Giant Unilamellar Vesicle)の作製</br>リン脂質一重膜で覆われたドロップレットが油と水の界面に形成されたリン脂質一重膜を通過することでリン脂質二重膜ベシクルを作製した。</br>10mM DOPCのストック溶液をAr ガスで乾燥させた脂質フィルムをミクロチューブ内に作り真空デシケータ内でさらに乾燥させた。リン脂質フィルムに流動パラフィン 500μLを加える。超音波洗浄機を用いて60℃で60分間リン脂質をオイルに溶かした。インナー溶液を150mM スクロース、350mM グルコース、100mM EGTAとする。オイルに溶かしたリン脂質にインナー溶液 50μLを加え、ボルテックスし、エマルション溶液を作製した。アウター溶液を600mM グルコースとする。アウター溶液 100μLにエマルション溶液 70μLを加える。遠心した後、チューブの底にたまったベシクルを取り出し、1.5% アルギン酸ナトリウムに加え、それをキャピラリ中に入れ、図のような装置で2～3分遠心し、400mM 塩化カルシウム 140μL中に滴下した。それを共焦点レーザー顕微鏡で観察すると、リポソームが含まれたアルギン酸ゲルビーズが確認された。</p> 

           <img src="http://openwetware.org/images/c/cc/Image0032.jpg"></br></br>

<h5>内部にBufferの入ったアルギン酸膜を作る</h5> ①図のように外側の太いキャピラリーと内側の細いキャピラリーを作成する。</br> キャピラリーは外径1mmのものを熱加工した。</br> ②溶液を作成する。</br> 外管溶液　1.5%アルギン酸ナトリウム溶液</br> 内管溶液　蛍光物質+mQ</br> ③２重キャピラリーを用いて2～3分遠心にかけ0.4M塩化カルシウム水溶液に滴下する。</br></br> <img src="http://openwetware.org/wiki/Image:%E7%84%A1%E9%A1%8C.png"></br> 完成したゲルビーズを共焦点レーザー顕微鏡で観察すると。下図のようにゲルビーズの内部に蛍光が確認できた。</br> <img src="http://openwetware.org/images/1/1d/Image_%E4%BB%AE.png">


<h3 id="experimentsubproject2">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">リポソーム班</font> </h3> <p>反応を開始するトリガーDNAが放出され、反応が開始されると、次にすべきは反応の連鎖である。有効成分と、新たなトリガーを含んだリポソームを破壊すれば、放出された構造物が、連鎖反応的に周囲のリポソームを破壊する。</br> 反応の連鎖は、リポソームの作成・トリガー及び内部構造体の作成・そのトリガーを実際に作用させる、という三段階に分けられる。</br></p>

<p><h4>・リポソームの作成</h4> まず、released trigger DNAにより、割られるリポソームを作成する。</br> </br> リポソームを作るリン脂質は、両親媒性であり(親水基hydrophilic group・疎水基hydrophobic groupを持つ)、水と接触すると、親水基が内部に水を取り込み内側を、疎水基が外側を向くように整列する。こうして球状のリポソームが作成できる。</br> </br> 脂質(DOPC)、脂質を溶かす溶媒(CHCl3)、TR-DHPEをミクロチューブにいれ、Arガスで乾かした。次に、観察用Bufferを加えたのち、湯煎してリポソームを作成した。リポソームは蛍光顕微鏡で観察した。</br> </br> <Img Src="http://openwetware.org/images/c/cf/Fig1_liposome.png"> <Img Src="http://openwetware.org/images/1/1c/Fig2_liposome.png"></br> Fig.1,2 separated, uni-lamella liposomes observed by a fluorescent microscopy</br> 蛍光顕微鏡で、数個のリポソームが観察された(Fig.1,2)。リポソームは、赤く膜のみが染色されており、個々に分かれたユニラメラリポソームが作成できた。</br> </p>

<p><h4>・一本鎖DNAをはやしたリポソームの作成</h4> 次に、作成したリポソームをDNAをトリガーとして割るには、トリガーDNAをリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションさせる必要がある。そこで、リポソームにコレステロール修飾DNAを添加し、表面に一本鎖DNAが現れるようにする。これを、トリガーDNA構造体の一部と相補的な配列を持つ一本鎖DNAとすれば、トリガーDNAがリポソーム表面に多数ハイブリダイゼーションする。 ここでは、割る前に、一本鎖DNAをはやしたリポソームを生成する。</br> </br> まず、ミクロチューブにDOPC、CHCl3を99μℓ加え、この溶液を乾燥させた。ここに観察用バッファーを入れ、整置水和した。</br> リポソームにコレステロール修飾したDNAをつけるため、作製したリポソームにcholesterol修飾DNAを加えた。</br> (上手く観察できなかったので、お盆明けに再度実験します)</p> </br> <h3 id="experimentsubproject3">外側からリポソームを破壊するサブプロジェクト <font size="2">B-Z班</font> </h3></br> 

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       </article>





       <article data-title="Future">

           <h2>On the other hand,</h2>
           <p>Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat. Duis aute irure dolor in reprehenderit in voluptate velit esse cillum dolore eu fugiat nulla pariatur. Excepteur sint occaecat cupidatat non proident, sunt in culpa qui officia deserunt mollit anim id est laborum.<br><img src="http://openwetware.org/images/5/57/Penguins.jpg" 
                                              width="450" height="450" align="center" alt="example-tab4" border="0"></p>
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       </article>

       <article data-title="Member">
           <h2>Team Member</h2>

           <p><h3>Freshman</h3></br>

Kota Kurosawa</br> Masataka Tashiro</br> Norihiro Iwamoto</br> Ryoma Toyosato</br> Yohei Kon</br> Yuichiro Ogawa</br>

<h3>Sophomore</h3></br>

Sunsuke Imai</br> Yoriko Hasida</br>

<h3>Junior</h3></br> Koichiro Katayama</br> Ryo Kageyama</br> Takahiro Tomaru</br> Takuto Hosoya</br> Thanapop Rodjana</br> </p> 

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       </article>
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                                     width="180" height="50" alt="Molcular Robotics Lab" border="0" align="right">

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