Etchevers:ChIP francais

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Revision as of 06:04, 2 July 2007 by Etchevers (talk | contribs) (Chromatin immunoprecipitation protocol in French)
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Overview

L'immunoprecipitation de la chromatine ou ChIP est une technique qui permet d'identifier les sites de liaison d'un facteur de transcription proteique sur l'ADN in situ. Base sur [1] et [2].

Materials

  • Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit d'Upstate, Catalog # 17-295
  • Préparation d’inhibiteurs de protéases Roche version MINI cat 04 693 159 : 25x = 0,42 ml eau par tablette (Version « complete EDTA-free » cat 04 693 132, c’est 2 ml par tablette)
  • tubes a microcentrifuge 1,5 ml
  • tubes a centrifuge 15 ml
  • sonicateur style Branson
  • potter ou mortier en agate et azote liquide
  • anticorps polyclonaux valides pour le ChIP y compris anti-histone H3 d'Abcam pour *temoin positif et anti-IgG pour temoin negatif
  • equipement d'electrophorese et agarose 1-2%
  • pipettes
  • gants
  • glace

Procedure

  1. Se procurer les tissus de souris. Prévoir 1 ml de fixateur par 100 mg de tissus dans un Falcon pré-pesé de 15 ml. Transférer les tissus avec PBS, centrifugation 1’ à 500g et enlever le surnageant avant de peser. Garder au froid et fixer aussitôt.

10 ml fixateur :

  • 9,33 ml PBS
  • 270 ul formaldéhyde 37%
  • (20 ul 0,5M EDTA)
  1. Fixer dans quelques ml pendant 10 ou 15 minutes à température ambiante avec rotation.
  2. Pendant ce temps, sortir le tampon « SDS Lysis Buffer » à température ambiante si on poursuit dans la foulée.
  3. Centrifugation 4ºC pour 30 secondes à 500g et/ou décanter fixateur immédiatement.
  4. Reprise dans 5-10 ml pour une concentration finale de 0,125M glycine :
  • Pour 10 ml de solution arrêt :
  • 8,25 ml PBS
  • 100 ul Triton X100 à 10% (conserver stock au frais)
  • (PBS + Triton X100 = « PBT »)

avec :

  • 1,25 ml glycine 1M
  • 400 ul inhibiteurs de protéases 25x
  1. Agiter doucement pendant 5 minutes pour arrêter la fixation.
  2. Centrifugation 4ºC pour 5 minutes à 500g. Décanter.
  3. Rincer avec PBT / 1x inhibiteurs de protéases sans glycine, toujours sur glace. Centrifugation et décantation.
  4. Enlever le surnageant autant que possible, reprendre les tissus dans 0,1 ml de SDS Lysis Buffer (tampon à faire à la main ainsi puisque le kit ne suffira pas en volume!).
  • Pour 50 ml SDS Lysis Buffer :
  • 2,5 ml de SDS 20% (1% final)
  • 1 ml de EDTA 0,5M pH 8 (10 mM final)
  • 2,5 ml de Tris 1 M pH 8.1 (50 mM final)
  • 40 ml H2O
  • 5 tablettes d’inhibiteurs de protéases Roche version MINI cat 04 693 159 (1 tablette si non version Mini)
  • Vérifier pH à la fin pour pH 8.1 puis qsp 50 ml.
  1. Broyer en mortier agate avec de l’azote ou avec potter sur glace. Repartir le broyat pour l’équivalent de 5 mg tissu par tube Falcon de 15 ml, compléter chaque tube Falcon à 400 ul avec du SDS Lysis Buffer.
  2. Garder 4 tubes pour une manipe puis congeler les autres à -30ºC ou -80ºC. Garder lysat sur glace a tout moment.
  3. Prendre avec un embout biseauté 300 ul de la bouteille resuspendue de Protein A-agarose/ssDNA (60 ul par tube prévu), centrifuger doucement et décanter surnageant.
  4. Reprendre les billes dans 1 ml ChIP Dilution Buffer plus 2% bovine serum albumin (BSA). Incuber 10 minutes dans la chambre froide sur agitateur.
  5. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant et jeter.
  6. Reprendre les billes dans 1 ml ChIP Dilution Buffer et repartir 200 l dans 5 tubes.
  7. Aux billes (ajouter 0,8ml ChIP Dilution Buffer dans les 4 premiers tubes) :
    1. Ajouter anti-S (6 ug) pour Tube Expérimental (ES) S
    2. Ajouter anti-P (4 ug) Tube Expérimental (EP) P
    3. Ajouter anti-histone H3 (4 ug) au Tube témoin Positif (P)
    4. Ajouter anti-IgG (4 ug) au Tube témoin Négatif avec anticorps (N)
    5. Ajouter 1 ml ChIP Dilution buffer + 2% BSA pour Tube Blanc sans anticorps (B)
  8. Incuber avec agitation au frais pendant 2h.
  9. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageants et (garder la prochaine fois !).
  10. Rincer avec 1 ml de ChIP dilution buffer + 2% BSA. Laisser 10-30 minutes à 4ºC en agitant.
  11. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageants et jeter. Ajouter 1 ml de ChIP Dilution buffer.
  12. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageants et jeter. Ajouter 60 l de ChIP Dilution buffer à chaque tube et réserver ces billes preparées au frigo.
  13. Sonication de 5 aliquots de 400 ul de chromatine dans l’eau glacée en récipient confiture :
    1. 6 x 20 secondes, espacées de 20 secondes, sur sonicateur Branson ou equivalent
    2. 1er sonication 30W, 2e et ensuite à 40W
    3. ne pas mousser ! sinon prendre un autre aliquot.
  14. Transvaser dans Eppendorfs 1,5ml et microcentrifuger 10 minutes 4ºC 13K g.
  15. Prendre surnageant et repartir par 200ul en 1 tube (B) et 400ul en 4 autres tubes (ES, EP, P, N) de 1,5 ml peu adhérents.
  16. [Prélever 80 ul de chaque tube et les pooler (400 ul) = Total Input DNA, 5% du chromatine soniqué au départ.]
  17. Ajouter à chaque tube de chromatine :
    1. 1100 ul (tube B) ou 900 ul (tube ES, EP, P, N) de tampon ChIP Dilution Buffer
    2. 50 ul inhibiteurs de proteases Roche 25x repris dans de l’eau
    3. 100 ul Protein A – Agarose / Salmon Sperm DNA (ou protein A-agarose maison)
    4. Incuber 1h à 4ºC avec agitation. Ceci débarrasse des protéines en gros excès « pre-clear ».
  18. Spin 700g 1 minute pour récupérer l’agarose au fond, reprendre surnageant dans de nouveaux tubes étiquettés et toujours sur glace.
  19. Le résidu de chromatine brute (200 ul) est utilisé pour vérification de la sonication sur gel agarose 1%.
    1. Ajouter 30 ul NaCL 5M et incuber en bloc chauffant à 99ºC 15’
    2. Refroidir et ajouter 2 ul RNase (DNase-free) et 3 ul protéinase K (stock 10-20mg/ml), incuber 37ºC 30’ puis 45ºC pendant 15’. (Sinon on voit un « smear » à cause de l’ARN et n’en parlons pas des protéines)
    3. Microcentrifugation vitesse maxi.
    4. Extraction phénol-chloroforme du surnageant
    5. Pour 250 ul de chromatine, ajouter 12 ul NaCl 5M et 0,5 ml EtOH 100% froid. Précipiter 30’ -30ºC ou 10’ sur carboglace.
    6. Centrifugation à 4ºC 30’ vitesse maxi.
    7. Rincer culot avec 500 ul EtOH 70% froid, décanter aussitôt (ou spin) et sécher culot.
    8. Reprendre dans 20 ul. Doser 1 ul sur spectrophotomètre ou Nanodrop.
    9. Déposer 5-10 ul (2-3 ug chromatine) sur gel en face d’un marqueur 100bp+. Prendre une jolie photo que tu publierais.
  20. Si la sonication s’est bien passée, ajouter aux surnageants appropriés, les billes Protein A-agarose-anticorps.
  21. Mettre dans la chambre froide sur agitateur la nuit.

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  1. Préparer tampon d’élution frais à conserver pour la fin :
    1. 1% SDS final (pour 2 ml = 0,2 ml de 10% SDS)
    2. 0,1 M NaHCO3 final (pour 2 ml = 0,2 ml de 1M)
  2. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute.
  3. Décanter surnageant – conserver de coté
  4. Sur les billes, ajouter :
    1. 1 ml de Low Salt Immune Complex Wash Buffer
    2. 10 minutes sous agitation 4ºC
    3. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – conserver de coté
  5. Sur les billes, ajouter :
    1. 1 ml de High Salt Immune Complex Wash Buffer
    2. 10 minutes sous agitation 4ºC
    3. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – conserver de coté
  6. Sur les billes, ajouter :
    1. 1 ml de LiCl Immune Complex Wash Buffer
    2. 10 minutes sous agitation 4ºC
    3. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – conserver de coté
  7. Sur les billes, ajouter :
    1. 1 ml de TE Buffer
    2. 5 minutes sous agitation température ambiante
    3. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – conserver de coté
  8. Sur les billes, ajouter encore une fois:
    1. 1 ml de TE Buffer
    2. 5 minutes sous agitation température ambiante
    3. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – conserver de coté
  9. Sur les 4 tubes de billes, ajouter maintenant 250 ul du tampon d’élution.
    1. Vortexer brièvement, puis agiter 15 minutes température ambiante.
    2. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute. Décanter surnageant – C’EST LA CHROMATINE – et mettre dans un tube 2 ml.
  10. Sur les billes, ajouter encore 250 ul tampon d’élution.
    1. Vortexer brièvement, puis agiter 15 minutes température ambiante.
    2. Centrifuger 700g à 4ºC pendant 1 minute.
  11. Décanter surnageant et ajouter aux surnageants précédents (500 ul total).
  12. Ajouter à chaque tube ainsi qu’au tube de 400 ul Total Input DNA (qsp 500 ul avec de l’eau): 20 ul NaCl 5M
    1. Incuber 4-6 h à 65-68ºC dans le bain sec (faire l’étape d’après en même temps)
  13. (Possibilité de les conserver à -20ºC)
  14. Ajouter aux 6 tubes (ES, EP, P, N, B et TID) :
    1. 10 ul EDTA 0,5M
    2. 20 ul Tris-HCl pH 6,5 1M
    3. 2 ul Protéinase K à 10 mg/ml
    4. Incubation 1h à 45ºC
  15. Y ajouter 1 ul RNAse pour 30 minutes à 37ºC.
  16. Protocol Qiaquick :
    1. Ajouter tampon PBI du kit qsp 2 ml et mélanger. Vérifier couleur jaune, sinon rectifier pH avec 10 ul acétate de sodium 3M, pH 5,0.
    2. Placer les colonnes Qiaquick marquées sur leurs tubes de collection. Y ajouter les echantillons jaunes E, P, N, B, TID par volume de 0,67 ml chaque.
    3. Passer ce volume en centrifugeant à la vitesse maxi pour 30 secondes. Vider le liquide passé et répéter 2x pour mettre tout l’ADN sur membrane.
    4. Laver la colonne : 750 ul tampon PE (avec son EtOH ajouté)
    5. Centrifuger 1 minute, vider le liquide passé.
    6. Remettre colonnes sur les mêmes tubes de collection, centrifuger à sec 1 minute. Placer sur des tubes propres de 1,5 ml.
    7. Eluer dans 30 ul de tampon EB [ou de l’eau ultrapure pH 7-8 si des ligations ensuivent].
  17. Garder à -30ºC ou passer tout de suite à la PCR.


Notes

  1. Depend enormement sur la sonication - aucune mousse ni rechauffement toleree !
  2. Depend aussi de la fixation - a varier entre 10 et 15 minutes total (y compris centrifugation) en faisant moins pour les histones et plus pour les petits facteurs de transcription
  3. Le labo de Peggy Farnham a UC Davis a quelques indications
  4. Les sites de Upstate et de Chemicon a quelques astuces aussi
  5. Ne pas oublier de voir les confreres frustres aussi sur le forum de discussion de Protocol Online

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References

Relevant papers and books

  1. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, and Farnham PJ. Comparison of sample preparation methods for ChIP-chip assays. Biotechniques. 2006 Nov;41(5):577-80. DOI:10.2144/000112268 | PubMed ID:17140114 | HubMed [OGeen2006]
  2. Elnitski L, Jin VX, Farnham PJ, and Jones SJ. Locating mammalian transcription factor binding sites: a survey of computational and experimental techniques. Genome Res. 2006 Dec;16(12):1455-64. DOI:10.1101/gr.4140006 | PubMed ID:17053094 | HubMed [Elnitski2006]

All Medline abstracts: PubMed | HubMed

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