Etchevers:Extraction ARN francais - Revision history

Reshma P. Shetty at 01:37, 10 May 2007

Reshma P. Shetty — Thu, 10 May 2007 01:37:07 GMT

←Older revision		Revision as of 01:37, 10 May 2007
Line 108:		Line 108:


-	[[Category:Protocol]]	+	[[Category:Protocol]] [[Category:In vitro]] [[Category:RNA]]

Etchevers: /* Technique */

Etchevers — Sun, 17 Dec 2006 20:54:51 GMT

Technique

←Older revision		Revision as of 20:54, 17 December 2006
Line 25:		Line 25:
	*Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus.		*Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus.
	<p></p>		<p></p>
		+	----
		+
	===Technique===		===Technique===

-	Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT	+	'''Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT'''

	1- Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus.		1- Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus.
Line 43:		Line 45:
	7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).		7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).
	<br>		<br>
-		+	<br>
-	Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy	+	'''Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy'''

	8- Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml.		8- Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml.
Line 52:		Line 54:
	10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.		10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.
	<br>		<br>
-	Etape 3 : Digestion à la DNase	+	<br>
		+	'''Etape 3 : Digestion à la DNase'''

	11- Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy.		11- Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy.
Line 70:		Line 73:
	17- Eliminer l’éluat.		17- Eliminer l’éluat.
	<br>		<br>
-	Etape 4 : Lavages	+	<br>
		+	'''Etape 4 : Lavages'''

	18- Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube.		18- Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube.
Line 82:		Line 86:
	22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.		22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.
	<br>		<br>
-	Etape 5 : Elution	+	<br>
		+	'''Etape 5 : Elution'''

	23- Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml.		23- Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml.

Etchevers: /* Technique */

Etchevers — Thu, 14 Dec 2006 15:14:58 GMT

Technique

←Older revision		Revision as of 15:14, 14 December 2006
Line 42:		Line 42:

	7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).		7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).
-	<~~p></p~~>	+	<br>
-	~~<p></p>~~	+
	Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy		Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy

Line 51:		Line 51:

	10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.		10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.
-	<~~p></p>~~	+	<br>
-	~~<p></p~~>	+
	Etape 3 : Digestion à la DNase		Etape 3 : Digestion à la DNase

Line 70:		Line 69:

	17- Eliminer l’éluat.		17- Eliminer l’éluat.
-	<~~p></p>~~	+	<br>
-	~~<p></p~~>	+
	Etape 4 : Lavages		Etape 4 : Lavages

Line 83:		Line 81:

	22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.		22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.
-	<~~p></p>~~	+	<br>
-	~~<p></p~~>	+
	Etape 5 : Elution		Etape 5 : Elution

Line 92:		Line 89:

	25- Répéter l’élution de l’étape 26 avec une 2e volume de 30 µl d’eau RNase free, mais sans attendre. Cette 2e élution ne devrait plus avoir beaucoup d'ARN, sauf si la colonne est surchargée, en lequel cas on récupere beaucoup.		25- Répéter l’élution de l’étape 26 avec une 2e volume de 30 µl d’eau RNase free, mais sans attendre. Cette 2e élution ne devrait plus avoir beaucoup d'ARN, sauf si la colonne est surchargée, en lequel cas on récupere beaucoup.
-

	==Notes==		==Notes==

Etchevers at 15:12, 14 December 2006

Etchevers — Thu, 14 Dec 2006 15:12:24 GMT

←Older revision		Revision as of 15:12, 14 December 2006
Line 42:		Line 42:

	7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).		7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).
-		+	<p></p>
	<p></p>		<p></p>
	Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy		Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy
Line 51:		Line 51:

	10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.		10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.
		+	<p></p>
	<p></p>		<p></p>
	Etape 3 : Digestion à la DNase		Etape 3 : Digestion à la DNase
Line 69:		Line 70:

	17- Eliminer l’éluat.		17- Eliminer l’éluat.
		+	<p></p>
	<p></p>		<p></p>
	Etape 4 : Lavages		Etape 4 : Lavages
Line 81:		Line 83:

	22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.		22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.
		+	<p></p>
	<p></p>		<p></p>
	Etape 5 : Elution		Etape 5 : Elution
Line 93:		Line 96:
	==Notes==		==Notes==
	#List troubleshooting tips here.		#List troubleshooting tips here.
-	~~#You can also link to FAQs/tips provided by other sources such as the manufacturer or other websites.~~
	#Anecdotal observations that might be of use to others can also be posted here.		#Anecdotal observations that might be of use to others can also be posted here.

Etchevers: /* Materiels */

Etchevers — Thu, 14 Dec 2006 15:04:53 GMT

Materiels

←Older revision		Revision as of 15:04, 14 December 2006
Line 5:		Line 5:

	==Materiels==		==Materiels==
-	Qiagen [http://http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilizationAndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB_BenchProtocol.pdf RNeasy Mini extraction kit] (ref 74104) or Midi (75144)	+	*Qiagen [http://http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilizationAndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB_BenchProtocol.pdf RNeasy Mini extraction kit] (ref 74104) or Midi (75144)
-	ethanol 70% et 100%	+	*ethanol 70% et 100%
-	azote liquide	+	*azote liquide
-	mortier et pilon en agate (si petit, sertis dans un grand mortier)	+	*mortier et pilon en agate (si petit, sertis dans un grand mortier)
		+	*proteinase K
		+	*cones avec filtres pour pipettes
		+	*tubes 1,5 ml microcentri en plastique sans RNase/DNase
		+	*tubes 15 ml style Falcon si grandes quantites

	==Procedure==		==Procedure==

Etchevers: /* Survol */

Etchevers — Thu, 14 Dec 2006 15:02:29 GMT

Survol

←Older revision		Revision as of 15:02, 14 December 2006
Line 2:		Line 2:
	==Survol==		==Survol==

-	Extraction de l’ARN total des tissus des vertébrés (dans notre cas, embryons de poulet/humain/souris) - jusqu'a ~~250~~ mg.	+	Extraction de l’ARN total des tissus des vertébrés (dans notre cas, embryons de poulet/humain/souris) - jusqu'a 25 mg.

	==Materiels==		==Materiels==

Etchevers at 15:02, 14 December 2006

Etchevers — Thu, 14 Dec 2006 15:02:12 GMT

New page

Protocole d'extraction des ARN (TISSUS)
==Survol==

Extraction de l’ARN total des tissus des vertébrés (dans notre cas, embryons de poulet/humain/souris) - jusqu'a 250 mg.

==Materiels==
Qiagen [http://http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilizationAndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB_BenchProtocol.pdf RNeasy Mini extraction kit] (ref 74104) or Midi (75144)
ethanol 70% et 100%
azote liquide
mortier et pilon en agate (si petit, sertis dans un grand mortier)

==Procedure==
===Avant de commencer===
*S’assurer que tout matériel et embouts nécessaires à la préparation des ARN est RNase-free.
*Port de gants obligatoires.
*Préparer la solution stock DNase I en dissolvant la DNase I solide (1500 unités kunitz) dans 550 µl d’eau RNase free fournie dans le kit. (attention à ne pas perdre de poudre de DNase I à l’ouverture du tube). Mélanger doucement par inversion du tube. NE PAS VORTEXER !!! Enfin aliquoter en tube de 20 µl et congeler à -20°C.
*Rajouter 4 volumes d’éthanol (96-100%) au tampon RPE.
*Préparer extemporanément de l’éthanol 70% : 14,7 ml d’éthanol 95% + 5,3 ml d’eau
*Rajouter le b-ME au tampon RLT (10 µl de b-ME pour 1 ml de tampon RLT : 20 µL + 1980 µl pour un culot).
*Laver la paillasse et les pipettes au RNAzap.
*Ne pas broyer plus de 250 mg de tissus.

===Technique===

Etape 1 : Dissociation et homogénéisation des cellules avec le tampon RLT

1- Préparer de la carboglace pour sortir les tubes contenant les tissus.

2- Laver le mortier à l'alcool et préparer de l'azote liquide.

3- Introduire un peu d'azote liquide dans le tube contenant le tissu et renverser le tout dans le mortier pré-refroidi.

4- Broyer le tissu doucement pour éviter les projections de tissus congelés et remettre de l'azote si le niveau baisse.

5- Introduire 350ul à 2 ml de tampon RLT dans le mortier puis récupérer ces 2 ml après décongélation dans un tube de 2 ml.

6- Passer le lysat tissulaire dans une colonne QIAshredder (3 fois 700 µl centrifuger 2 minutes à vitesse maximale ou tout en une fois).

7- Ajouter X ml (vol/vol) d’éthanol à 70% au lysat homogénéisé et bien mélanger en secouant vigoureusement. (NE PAS CENTRIFUGER!!!).


Etape 2 : Purification des ARN sur colonne RNeasy

8- Appliquer l’homogénat (incluant tout précipité qui a pu se former) à une colonne RNeasy mini ou midi placée dans un tube à centrifuger de 15 ml.

9- Fermer le tube et centrifuger 5 min à 10 000 rpm.

10- Eliminer l’éluat, les ARN sont sur la colonne.

Etape 3 : Digestion à la DNase

11- Ajouter (350 µl) 2 ml de tampon RW1 dans la colonne RNeasy.

12- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour laver la colonne.

(Pendant la centrifugation, ajouter 70 µl de tampon RDD à l'aliquot de 10 µl de DNase I préparée, garder sur glace).

13- Eliminer l’éluat.

14- Rajouter les 80 µl de la solution de DNase I (préparée pendant l’étape 12) dans la colonne (directement sur la membrane) et laisser en contact 15 min à température ambiante (20-30°C) sur la paillasse.

15- Ajouter (350µl) 2 ml du tampon RW1 sur la colonne RNeasy et laisser 5 min sur la paillasse.

16- Centrifuger 2 min à vitesse maximum.

17- Eliminer l’éluat.

Etape 4 : Lavages

18- Ajouter (700µl) 2,5 ml de tampon RPE reconstitué à la colonne RNeasy. Fermer le tube.

19- Centrifuger 1 min à vitesse maximum (pour laver la colonne).

20- Eliminer l’éluat.

21- Ajouter une nouvelle fois (700µl) 2,5 ml de tampon RPE à la colonne RNeasy. Fermer le tube.

22- Centrifuger 2 min à vitesse maximum pour sécher le gel/membrane de la colonne. Vider le tube à collection, re-centrifuger 1 minute.

Etape 5 : Elution

23- Pour éluer l’ARN, transférer la colonne RNeasy sur un nouveau tube collecteur de 1,5 ml.

24- Pipeter 30 µl d’eau RNase free et déposer directement sur la membrane de la colonne. Attendre au moins 1 min puis centrifuger pendant 1 minute à 700 rpm puis 2 min à vitesse maximum. On peut aussi y mettre que 10 µl, puis spin 1 minute, puis ajouter 20 µl, re-spin.

25- Répéter l’élution de l’étape 26 avec une 2e volume de 30 µl d’eau RNase free, mais sans attendre. Cette 2e élution ne devrait plus avoir beaucoup d'ARN, sauf si la colonne est surchargée, en lequel cas on récupere beaucoup.

==Notes==
#List troubleshooting tips here.
#You can also link to FAQs/tips provided by other sources such as the manufacturer or other websites.
#Anecdotal observations that might be of use to others can also be posted here.

Please sign your name to your note by adding <nowiki>'''*~~~~''':</nowiki> to the beginning of your tip.

==References==
Plenty - please help add them in here.

==Contact==
--[[User:Etchevers|Alethea]] 10:02, 14 December 2006 (EST)

[[Category:Protocol]]