IGEM:Chiba/2009/Brainstorming/log/2

14/Aug/2009

ホワイトボード写真

21/Aug/2009

クロストークについて

クロストーク関連の論文で、まえ送ったモノのなかの Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing についてです。

さいご、６つグラフがあって、それは

luxRIP(pSB401)(A、B)、

rhlRIP(pSB406)(C、D)、

lasRIP(pSB1075)(E、F)

と、

各種AHL(基本部品についてる基　AHLの名称)

CH3CH2CH2 N-Butanoyl-L-homoserine lactone BHL

CH3(CH2)4 N-Hexanoyl-L-homoserine lactone HHL

CH3(CH2)6 N-Octanoyl-L-homoserine lactone OHL

CH3(CH2)8 N-Decanoyl-L-homoserine lactone DHL

CH3(CH2)10 N-Dodecanoyl-L-homoserine lactone dDHL

CH3COCH2 N-3-(Oxobutanoyl)-L-homoserine lactone OBHL

CH3(CH2)2COCH2 N-3-(Oxohexanoyl)-L-homoserine lactone OHHL

CH3(CH2)4COCH2 N-3-(Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone OOHL

CH3(CH2)6COCH2 N-3-(Oxodecanoyl)-L-homoserine lactone ODHL

CH3(CH2)8COCH2 N-3-(Oxododecanoyl)-L-homoserine lactone OdDHL

CH3(CH2)10COCH2 N-3-(Oxotetradecanoyl)-L-homoserine lactone OtDHL

の応答を示しています。

ちなみに

OHHLがLux

BHL, HHLがRhI

OdDHLがLas

のIシリーズがだすAHLの種類です。

グラフACEには BLH（□）とHHL（○）と、各Rシリーズの反応がかかれています。

グラフBDFには OHHL（○）とOdHL（●）と、各Rシリーずの反応がかかれています。

んで、ここまで言ってあれなのですがグラフの縦軸をみてください。

Relative　Light　Units　とありますが

AB：CD：EFのMaxがそれぞれ1000：4：1です。

これをみると複数のRを使うには

ポジティブフィードバック（またはトグル??）の重要性を感じざるを得ないッ！と考えてしまいます。

どのくらいの速度で、各AHLが出力されるかというデーターがないと

微妙ですが、 一応応答濃度について注目すると

LuxRに対数応答開始濃度はざっと（本当にざっと）、見ると

LuxI:RｈｌI:LasI=１（濃度10-9乗~-7）：１：１００

RhlRは

LuxI:RhlI:LasI=：１：１（-11~-9）：１０？

LasRは

LuxI:RhlI:LasI=10000：10000：１（-11~-9）

であって これだけみると（蓄積速度がわからないとなんともいえないんだけど）

Biobrickを使った直列通信ならば、

（pLac-LuxI(or RhlI)）→（pTet-LuxR(or RhlR)-T-T-pLux(or pRhl)-YFP-LasI）→（pTet-LasR-T-T-pLas-GFP）

という2段階が限界と考えます。

ここでクローニングの必要がでてくるのは色を塗った部分です。

１つめについて

とりあえず全部ひとつのプラスミドに入れているようにしていますが、そうゆう必要はないと思います。

また緑・オレンジの部分はポジティブフィードバックもかんがえなければなりません。

具体的なクローニング（どのパーツをつかうのか・どういった手順をとるのか）については、今日中にまたメールします。

つくるもの

まず、私たちは時間の流れを同一系内で示すために 直列系と並列系のシステムを考えています。

ここでいう時間の流れの表現の仕方とは、レポーターの発現順序にあたります。

で、 まず直列系のシステムについて

クロストークしないクオラムセンシングを利用して、２段階のスイッチをつくります。 ここで、細胞内の機構を利用しない理由は、 段階ごとにレポーターの出力を出そうと思っているので、 １個体で複数の時間差の応答をだすのは、機能的に複雑であり、難しいと考えたからです。

で、実際つくりたいシステムは

（pLac-LuxI(or RhlI)）→（pTet-LuxR(or RhlR)-T-T-pLux(or pRhl)-（レポーター）-LuxI-LasI）→（pTet-LasR-T-T-pLas-（レポーター））

という２段階の通信システムです。 先ほど送ったメールは、このシステムをつくるための回路設計案です。 Aがいっぱいとかいいましたがそれについては、他で説明します。

最初はレポーターはGFPに統一したモノをつかいます。 実際パーツができた後では、個体培地を使った実験を行いたいとおもっています。 なので培地乗のAHL拡散速度について、なにかヒントになりそうな論文をさがしています。 拡散係数とかわかればいいんですけど。

次に 並列系のシステムについて。 並列系のシステムは、LuxRのミュータントを使ったものです。 これも最初はGFPをレポーターにしたものをつかいたいと考えています。

直列系・並列系共に センダーを（pLac-LuxI）http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012 に統一して行います。

具体的なパーツ

（pLac-LuxI） http://partsregistry.org/Part:BBa_K084012　（千葉にある：pSB1AK3）

①（pTet-LuxR-T-T-pLux-GFP-LuxI-LasI） を作るために使うパーツ

T9002: pTetR-RBS34-LuxR-TT-pLux-32-GFP-TT　　（9A・たぶん千葉にプラスミドある：pSB1A3）

http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_T9002 の回路末端のTTとって C0061：LuxI　（１－4M　pSB1A2） と C0178:LasI (2-8K pSB1A2)

つけて終了。

②（pTet-LuxR-T-T-pLux-RFP-LuxI-LasI）

I731012: pTetR-RBS34-LuxR-TT-pLux-32-RFP-TT http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_I731012 のTTとって C0061：LuxI と C0178:LasI つけて終了。 ③（pTet-LuxR-T-T-pLux-YFP-LuxI-LasI） K084003:pTet-34-LuxR-TT-pLux-VenusYFP　　（注文（千葉にあるけど）：pSB1A2）

http://partsregistry.org/Part:BBa_K084003 に C0061：LuxI（１－4M　pSB1A2） と C0178:LasI (2-8K pSB1A2) つけて終了。 ２手。こっちのほうが早い。

④（pTet-LasR-T-T-pLas-GFP-LasI） を作るためにつかうぱーつ

K091134：pLac-RBS34-LasR-t-t-pLasPAI-RBS-GFP-t-t　　（要注文：pSB1AK3） http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K091134 から最後の-t-t-のぶぶんをとって C0178：LasI(2-8K pSB1A2) http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_C0178 につなげる。

⑤（pTet-LasR-T-T-pLas-RFP-LasI） ダブルトランスフォーメーションで考えます。 （１） K084005:pTet-34-LasR　　（要注文だが千葉にある！：pSB1A2）

http://partsregistry.org/Part:BBa_K084005

（２） S03881:pLasPAI-34-RFP　　（要注文：pSB2K3）

http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_S03885 と C0178：LasI(2-8K pSB1A2) をつなげます。

25/Aug/2009

回路図案