IGEM:Kyoto/2010/project: Difference between revisions
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[[Image:Igem_kyoto2010_rpuvsod.png| | [[Image:Igem_kyoto2010_rpuvsod.png|300px|thumb|left|縦軸細胞数、横軸をIPTG濃度に対応するプロモーター活性で結果を示しています。プロモーター活性が0.05~0.1の範囲においてCell Lysisの活性が大きく変化しています。]] | ||
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Revision as of 04:31, 5 December 2010
- こちらでは、iGEM Kyoto2010のプロジェクト"the Fantastic Lysisbox"を簡単に紹介しています。
- 英語でも大丈夫!もっと詳しく知りたい!という方は、本番用のポスターやwikiを是非ご覧ください。
- Team Kyoto wikiページ
- 本番用ポスター
Introduction
Cell Lysisの必要性
- Cell Lysisとは、「細胞が溶ける」という現象です。
- λファージ由来のLysis cassetteという遺伝子を発現させることで、大腸菌の細胞壁が溶けて中身が放出されます。この現象は、
- 大腸菌に作らせた有用な物質(薬物、香り、色素など)を、特定の環境下で自動的に放出する
- 役目を終えたら自殺することで、組み換え生物によるバイオハザードを防ぐ
- 細胞死機構として様々に活用できます。
- そのためCell Lysisを自在に制御する機構は非常に応用性が広く、遺伝子工学の発展に重要な役割をもつと考えられます。
Lysis cassetteの機構
- Lysis cassetteという遺伝子のセットからは、主にホリンとエンドライシンというタンパク質が合成されます。
- ホリンは細胞膜上に集まって穴を形成し、その穴を通り抜けてエンドライシンが、細胞壁(を支えるペプチドグリカン)を破壊します。その結果、浸透圧によって細胞膜が破裂してCell Lysisが起こります。
Cell Lysisの機能評価
- 以上のように細胞死機構は重要なものなので、当然「cell Lysis」のパーツは過去のiGEMチームによっていくつか既に作られていました。しかし、パーツとして使いやすさを向上するためには、定量的な機能評価が大切です。
- どれぐらいの働きをするのか?つまり、パーツを組み込んだ大腸菌を殺せるか(溶かせるか)?
- ということを「プロモーター活性」で表すことにしました。
プロモーター活性とは?
- 遺伝子の発現はDNA→mRNA→タンパク質 という順に起こります。RNAポリメラーゼがプロモーター配列こ結合して、DNA上をスライドしながら遺伝情報をmRNAとしてとりだします(転写)。このmRNAがタンパク質に変換(翻訳)されて、そのタンパク質が様々な機能を担います。
- プロモーター活性とは、「そのプロモーターのRNAポリメラーゼと結合できる強さ」を表します。
- 大腸菌では「DNA→mRNA:転写」の段階で遺伝子の発現を制御しているので、目的の遺伝子が働くかどうかは、このプロモーター活性が重要になります。
- プロモーターの中には、特定の環境や物質に応じてプロモーター活性が上がるものが多種多様に存在しています。このようなプロモーターのパーツも色々開発されています。
- これらとLysis cassetteを組み合わせることによって、様々な条件下でCell Lysisを誘導することが可能になりますが、どんなプロモーターでも細胞死を起こすのみ十分にLysis cassetteを発現させることができる、というわけではないはずです。
- どれぐらいプロモーター活性があればLysis cassetteが働くのかを解析しました。
実験
遺伝子回路
- pLac(ラクトースプロモーター)によってLysis cassetteの発現を制御する、下の回路を使って機能評価を行いました。
- pLacとは、ラクトースリプレッサーによって制御されているプロモーターで、LacIが結合すると下流の配列の転写が進まなくなります。
- IPTGが存在すると、LacIに結合して不活性化するので、遺伝子の発現が誘導されるようになります。
誘導条件とCell Lysis
- 上の遺伝子回路を形質転換した大腸菌を様々なIPTG濃度で培養し、細胞の数の変化を吸光度(OD550)で30分ごとに計測しました。
- 次に、Cell Lysisの活性を定量的に評価するため、細胞数が変化しなくなった時間(16時間後)での細胞数を、様々なIPTG濃度で計測し、比較しました。
Lysisbox
- さらに汎用性のある細胞死機構をめざしてLysisboxを考えました。
- ここではLysis cassetteと、Lysis cassetteと拮抗的に作用してCell Lysisを阻害するAnti-Lysis遺伝子を用います。2つの発現をそれぞれ(独立に)制御して、どんなプロモーターでもCell Lysisを誘導できるようにする仕組みです。