IGEM:Peking/2007/Switch: DNA digestion

限制性内切酶反应

酶切效率受Buffer影响很大，Buffer的选择参照各种限制性内切酶在不同Buffer中的活性及双酶切Buffer表

多数限制性内切酶的最佳活性温度是37℃，但也有例外，如SmaI的酶切温度为30℃，SfiI的酶切温度为50℃。

通常的酶切体系包括质粒/PCR产物，酶，Buffer和水，有时也包含BSA和Triton X-100。酶切检测体系不大于20uL，切载体和PCR片段的体系通常为100uL。

检测用质粒浓度以酶切后最小片段可见为宜。载体浓度不大于1ug，PCR片段浓度不小于1ug。

限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

尽量减少高甘油，低DNA浓度的情况有助于限制Star活性。由于酶保存液为甘油，加酶体积最大为体系的10%，对于有Star活性的酶应当更低，且适当增大DNA量，减少酶切时间。

部分限制性内切酶活性受甲基化影响，具体参照甲基化影响表

PCR末端酶切效率低，因此通常要在PCR末端的酶切位点外加保护碱基，具体参照PCR末端酶切效率表

进行连接前需要先将酶失活，不同酶的失活条件不同，具体参见失活条件表。

酶切检测通常1hr已经足够。切载体和PCR片段由于需要尽可能消化干净，往往要将酶切时间延长至16hr。部分酶失活很快，需要在酶切过程中补加，具体参照长时间酶切残存活性表。

勿将酶拿出冷冻室，如要短时间拿出一定要用冰盒。

防止不同酶间相互污染

将酶稀释在Buffer中后，如不能马上进行反应，应将反应液保存在4℃