IGEM:Peking/2007/Switch: DNA digestion

From OpenWetWare

< IGEM:Peking | 2007
Revision as of 08:42, 18 October 2007 by Chen Chongyi (Talk | contribs)
(diff) ←Older revision | Current revision (diff) | Newer revision→ (diff)
Jump to: navigation, search

Contents

限制性内切酶反应

Buffer的选择

酶切效率受Buffer影响很大,Buffer的选择参照各种限制性内切酶在不同Buffer中的活性及双酶切Buffer表

酶切温度

多数限制性内切酶的最佳活性温度是37℃,但也有例外,如SmaI的酶切温度为30℃,SfiI的酶切温度为50℃。

酶切体系

通常的酶切体系包括质粒/PCR产物,酶,Buffer和水,有时也包含BSA和Triton X-100。酶切检测体系不大于20uL,切载体和PCR片段的体系通常为100uL。

酶切DNA浓度

检测用质粒浓度以酶切后最小片段可见为宜。 载体浓度不大于1ug,PCR片段浓度不小于1ug。

Star活性

限制酶在一些特定条件下使用时,对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断,这个现象叫Star活性。

尽量减少高甘油,低DNA浓度的情况有助于限制Star活性。由于酶保存液为甘油,加酶体积最大为体系的10%,对于有Star活性的酶应当更低,且适当增大DNA量,减少酶切时间。

甲基化影响

部分限制性内切酶活性受甲基化影响,具体参照甲基化影响表

PCR末端酶切

PCR末端酶切效率低,因此通常要在PCR末端的酶切位点外加保护碱基,具体参照PCR末端酶切效率表

失活条件

进行连接前需要先将酶失活,不同酶的失活条件不同,具体参见失活条件表。

酶切时间

酶切检测通常1hr已经足够。切载体和PCR片段由于需要尽可能消化干净,往往要将酶切时间延长至16hr。部分酶失活很快,需要在酶切过程中补加,具体参照长时间酶切残存活性表。

NOTICE

勿将酶拿出冷冻室,如要短时间拿出一定要用冰盒。

防止不同酶间相互污染

将酶稀释在Buffer中后,如不能马上进行反应,应将反应液保存在4℃

Personal tools