IGEM:Peking/2007/Switch: PCR

From OpenWetWare

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Line 1: Line 1:
-
聚合酶链式反应
+
==聚合酶链式反应==
-
酶的选取:
+
===酶的选取===
Taq酶不具有3’->5’外切活性,保真度低,一般只作检测用,不用来克隆基因。
Taq酶不具有3’->5’外切活性,保真度低,一般只作检测用,不用来克隆基因。
Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶,具有部分3’->5’外切活性,保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。
Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶,具有部分3’->5’外切活性,保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。
Line 6: Line 6:
KOD plus的延伸速度,保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性,KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus,只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。
KOD plus的延伸速度,保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性,KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus,只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。
-
PCR体系
+
===PCR体系===
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug(取决于靶序列含量),dNTP 200uM每种,引物50pmol每种,酶1U,缓冲液和水。模板可以是质粒,Lambda DNA,菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜,低特异性引物可长至30~35bp。
一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug(取决于靶序列含量),dNTP 200uM每种,引物50pmol每种,酶1U,缓冲液和水。模板可以是质粒,Lambda DNA,菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜,低特异性引物可长至30~35bp。
-
常用的Taq系列聚合酶反应体系
+
===常用的Taq系列聚合酶反应体系===
克隆基因用
克隆基因用
Template 1uL
Template 1uL
Line 20: Line 20:
50uL system
50uL system
-
菌落PCR检测用
+
===菌落PCR检测用===
10×PCR buffer(Ex/LA) 1.5uL
10×PCR buffer(Ex/LA) 1.5uL
10×dNTP 1.5uL
10×dNTP 1.5uL

Revision as of 08:08, 18 October 2007

Contents

聚合酶链式反应

酶的选取

Taq酶不具有3’->5’外切活性,保真度低,一般只作检测用,不用来克隆基因。 Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶,具有部分3’->5’外切活性,保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。 以上3种Taq酶都可以在产物末端加A,因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。 KOD plus的延伸速度,保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性,KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus,只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。

PCR体系

一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug(取决于靶序列含量),dNTP 200uM每种,引物50pmol每种,酶1U,缓冲液和水。模板可以是质粒,Lambda DNA,菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜,低特异性引物可长至30~35bp。

常用的Taq系列聚合酶反应体系

克隆基因用 Template 1uL 10×PCR buffer(Ex/LA) 5uL 10×dNTP 5uL Primer-F 1uL Primer-R 1uL Ex/LA Taq 0.25uL ddH2O 36.75uL 50uL system

菌落PCR检测用

10×PCR buffer(Ex/LA) 1.5uL 10×dNTP 1.5uL Primer-F 0.5uL Primer-R 0.5uL Ex/LA Taq 0.1uL ddH2O 11uL 15uL system

一般Taq系列聚合酶的反应条件为 1.94℃ 5min Taq酶热激活 2.94℃ 30s DNA变性 3.Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度,范围45~68℃,以60~68℃为宜 4. 72℃ ETs ET为延伸时间,1kb/min 重复2~4,25个循环,增加循环数可以增大产物量,但是会引入更多突变。 5. 72℃ 10min 在产物末端加A,不需要加A时可省去此步

Personal tools