IGEM:Peking/2007/Switch: PCR

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Contents

聚合酶链式反应

酶的选取

  Taq酶不具有3’->5’外切活性,保真度低,一般只作检测用,不用来克隆基因。
   Ex Taq与LA Taq是Takara改造后的Taq酶,具有部分3’->5’外切活性,保真度有所提高。LA Taq更适用于PCR长链和GC含量高的模板。一般800bp以下基因可以考虑用Ex Taq进行克隆。1.5kb以下基因可以考虑用LA Taq进行克隆。Ex Taq的扩增效率最高。
   以上3种Taq酶都可以在产物末端加A,因此它们的PCR产物可以直接连接T载体。
   KOD plus的延伸速度,保真度均比Taq酶有明显提高。但是由于其3’->5’外切活性,KOD的扩增能力低于Taq系列的聚合酶。克隆基因应当首选KOD plus,只有KOD plus无法得到有效扩增时才考虑其他的聚合酶。

PCR体系

   一般Taq系列聚合酶的体系为模板1ng~1ug(取决于靶序列含量),dNTP 200uM每种,引物50pmol每种,酶1U,缓冲液和水。模板可以是质粒,Lambda DNA,菌落和基因组。高特异性引物以20bp为宜,低特异性引物可长至30~35bp。

常用的Taq系列聚合酶反应体系

克隆基因用

Template 1uL

10×PCR buffer(Ex/LA) 5uL

10×dNTP 5uL

Primer-F 1uL

Primer-R 1uL

Ex/LA Taq 0.25uL

ddH2O 36.75uL

50uL system

菌落PCR检测用

10×PCR buffer(Ex/LA) 1.5uL

10×dNTP 1.5uL

Primer-F 0.5uL

Primer-R 0.5uL

Ex/LA Taq 0.1uL

ddH2O 11uL

15uL system

一般Taq系列聚合酶的反应条件为

1.94℃ 5min Taq酶热激活

2.94℃ 30s DNA变性

3.Tm-5~10℃ 30s Tm为引物退火温度,范围45~68℃,以60~68℃为宜

4. 72℃ ETs ET为延伸时间,1kb/min

重复2~4,25个循环,增加循环数可以增大产物量,但是会引入更多突变。

5. 72℃ 10min 在产物末端加A,不需要加A时可省去此步

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