IGEM:Peking/2007/Switch: Plasmid mini prep

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Contents

Plasmid Mini Prep

procedure

1.挑取单克隆菌落,在约2mL适当抗性的LB培养基中培养至饱和。

2.打开离心机,设定为1,3000rpm,4℃

3.将约1.5mL培养物倒入1.5mL离心管中,盖管盖,适当标记,离心30s。剩余培养物保存在4℃。

4.将培养液倒出,残存培养液用200uL枪头吸干净,使沉淀尽量干燥。

5.将适量Solution I(保存于4℃)倒在1.5mL离心管中。每管细菌沉淀加入100uL分装后的 Solution I,盖管盖,用votex重悬至无可见的块状沉淀。

6.将适量Solutin II(保存于室温)倒在1.5mL离心管中。开管盖,每管加入200uL分装后的Solution II,盖管盖,快速颠倒离心管5次,溶液变澄清,开管盖,同时可见透明丝状物。

7.将适量Solution III(保存于4℃)倒在1.5mL离心管中。每管加入150uL分装后的Solution III,盖管盖,倒置离心管,温和震荡10次,可见白色粘稠不溶物。

8.离心4min。同时在新的1.5mL离心管上做好适当标记,每管加入400uL酚氯仿(保存于4℃,吸下层)。将各种溶液放回原处。

9.离心后可见较紧致的白色沉淀。将上清用1000uL枪头吸入对应的加好酚:氯仿的离心管中,每个样品间换枪头。盖管盖,温和振荡混匀。

10.离心2min,同时在新的1.5mL离心管上做好适当标记(此次为正式标记),每管加入800uL100%乙醇(保存于4℃)。 离心后可见溶液分两层,两相间有少量白色沉淀。将上清用200uL枪头小心吸入对应的加好乙醇的离心管中(防止吸入白色沉淀),每个样品间换枪头。盖管盖,温和振荡混匀。

如果不慎将酚氯仿粘到手上,应尽快涂大量去垢剂后用水洗掉!

11.离心10min,将溶液放回原处。

如是低拷贝质粒,应在离心前静置30min。

12.离心后可见白色沉淀,倒出上清。

13.将适量70%乙醇(保存于4℃)倒在1.5mL离心管中。开管盖,每管加入200uL分装后的70%乙醇,盖管盖,清洗管壁和沉淀。

14.离心1min,将乙醇倒出,残存的乙醇用200uL枪头吸干净,使沉淀尽量干燥。于37℃干燥10min至无明显的乙醇味道。同时溶解2×RNase。

每管加入20uL2×RNase,每个样品间换枪头,盖管盖,于37℃孵育。

15.配制适当的酶切体系对质粒进行检测。将质粒保存于4℃

将阳性质粒保存于-20℃,丢弃隐性质粒。如有需要,将阳性质粒对应的菌液送测序。丢弃剩余菌液。

溶液配方

Solution I

200mL

1M 葡萄糖 10mL

1M Tris•Cl (pH 8.0) 5mL

0.5M EDTA (pH 8.0) 4mL

定容至200mL,115℃ (6.895×104Pa)蒸汽灭菌15min。

Solution II

200mL

10M NaOH 4mL

10% SDS 20mL 1% SDS

定容至200mL

Solution III

200mL

5M KAC 120mL

HAC 23mL

H2O 57mL

酚:氯仿

100mL

Tirs饱和酚(pH 8.0)(下层) 50mL

氯仿 48mL

异戊醇 2mL

静置过夜后使用。

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