http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:Colony_PCR_protocol&action=history Revision history for this page on the wiki en MediaWiki 1.13.2 Fri, 24 May 2013 18:02:57 GMT http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:Colony_PCR_protocol&diff=368822&oldid=prev <p></p> <table style="background-color: white; color:black;"> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <tr valign='top'> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">←Older revision</td> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">Revision as of 06:27, 20 November 2009</td> </tr> <tr><td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td> <td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td></tr> <tr><td class='diff-marker'>-</td><td style="background: #ffa; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;PCR supermix&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VF2&quot;&gt;VF2 &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VR&quot;&gt;VR &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;colony template<del class="diffchange diffchange-inline">&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Parameters:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;X - 1 min per kb of expected product.</del>&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Thermocycler&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Electrophoretic unit&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Reaction Mixture&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR supermix&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VF2&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;colony template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Colony PCR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;9 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;PCR conditions&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Program a standard thermocycler to run the reaction using the following parameters:&lt;br&gt;Initial denaturation&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;95°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;15 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;Thermocycling&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;No. of cycles: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;39&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;94°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Anneal: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;56°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;68°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;<del class="diffchange diffchange-inline">X</del>&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Elongation time : I typically round up for this step. i.e. For a 3.6kb construct, I used a 4 min elongation time. It seems to help to be a bit generous with the elongation time.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Termination&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;60°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Hold: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;4°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, until removed from machine &lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Perform agarose gel electrophoresis of appropriate quantity of&nbsp; PCR products mixed with ethidium bromide and visualize with UV transilluminator to confirm the presence of required product.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/html&gt;</div></td><td class='diff-marker'>+</td><td style="background: #cfc; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;PCR supermix&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VF2&quot;&gt;VF2 &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VR&quot;&gt;VR &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;colony template&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Thermocycler&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Electrophoretic unit&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Reaction Mixture&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction <ins class="diffchange diffchange-inline">in reaction tube (1)</ins>:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR supermix&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VF2&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;colony template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Colony PCR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;9 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;PCR conditions&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Program a standard thermocycler to run the reaction using the following parameters:&lt;br&gt;Initial denaturation&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;95°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;15 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;Thermocycling&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;No. of cycles: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;39&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;94°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Anneal: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;56°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;68°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;<ins class="diffchange diffchange-inline">60 secs</ins>&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Elongation time : <ins class="diffchange diffchange-inline">1 min per kb of expected product. </ins>I typically round up for this step. i.e. For a 3.6kb construct, I used a 4 min elongation time. It seems to help to be a bit generous with the elongation time.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Termination&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;60°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Hold: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;4°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, until removed from machine &lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Perform agarose gel electrophoresis of appropriate quantity of&nbsp; PCR products mixed with ethidium bromide and visualize with UV transilluminator to confirm the presence of required product.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol<ins class="diffchange diffchange-inline">&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;TOTAL TIME REQUIRED FOR THE COMPLETION OF THE PROTOCOL :&lt;font color=#357EC7&gt;~ 1 hr, 55 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/p</ins>&gt;&lt;/html&gt;</div></td></tr> <!-- diff generator: internal 2013-05-24 18:02:57 --> </table> Fri, 20 Nov 2009 06:27:47 GMT Vaishnavi Ananth http://www.openwetware.org/wiki/Talk:Knight:Colony_PCR_protocol http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:Colony_PCR_protocol&diff=353271&oldid=prev <p>New page: &lt;html&gt;&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;PCR supermix&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VF2&quot;&gt;VF2 &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VR&quot;&gt;V...</p> <p><b>New page</b></p><div>&lt;html&gt;&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;PCR supermix&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VF2&quot;&gt;VF2 &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt; &lt;a name=&quot;VR&quot;&gt;VR &lt;i&gt;&lt;br&gt;&lt;tab&gt;&lt;div style=&quot;margin-right: 600px;&quot;&gt;(40 µM)&lt;/div&gt;&lt;/i&gt;&lt;/a&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;colony template&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Parameters:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;X - 1 min per kb of expected product.&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Thermocycler&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Electrophoretic unit&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Reaction Mixture&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR supermix&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VF2&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;VR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;colony template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Colony PCR&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;9 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;PCR conditions&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;Program a standard thermocycler to run the reaction using the following parameters:&lt;br&gt;Initial denaturation&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;95°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;15 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;Thermocycling&lt;br&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;No. of cycles: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;39&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Denature: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;94°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Anneal: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;56°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;30 secs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;68°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;X&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Elongation time : I typically round up for this step. i.e. For a 3.6kb construct, I used a 4 min elongation time. It seems to help to be a bit generous with the elongation time.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Termination&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Elongate: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;60°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Hold: &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;4°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;, until removed from machine &lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Perform agarose gel electrophoresis of appropriate quantity of PCR products mixed with ethidium bromide and visualize with UV transilluminator to confirm the presence of required product.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/html&gt;</div> Thu, 24 Sep 2009 10:08:03 GMT Vaishnavi Ananth http://www.openwetware.org/wiki/Talk:Knight:Colony_PCR_protocol