http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:In_vitro_transcription_protocol&feed=atom&action=history 2013-05-20T00:42:37Z Revision history for this page on the wiki MediaWiki 1.13.2 http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:In_vitro_transcription_protocol&diff=368820&oldid=prev 2009-11-20T06:20:01Z

<p></p> <table style="background-color: white; color:black;"> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <tr valign='top'> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">←Older revision</td> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">Revision as of 06:20, 20 November 2009</td> </tr> <tr><td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td> <td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td></tr> <tr><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;</div></td><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;</div></td></tr> <tr><td class='diff-marker'>-</td><td style="background: #ffa; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;RNase-free water&lt;/li&gt;&lt;li&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaseI buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNase&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Incubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Prepare template DNA&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;font color = &quot;red&quot;&gt;&lt;i&gt;Generate linearized template via PCR. Do a 100 <del class="diffchange diffchange-inline"> µl </del>reaction using VF2 and VR.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Can be done once, frozen and reused.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 1: Preincubate repressor and DNA&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Measure out &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;repressor&lt;/font&gt; into <del class="diffchange diffchange-inline">a </del>reaction tube.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Do the same for relevant controls.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;room temperature&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 hrs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;repressor-DNA mixture&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;22 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;(or)&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 2: Set up transcription reaction&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;DNase treatment (Optional)&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This step hasn't been tried.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;An optional step is to treat the reaction with RNase free DNaseI to remove the template DNA.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;<del class="diffchange diffchange-inline">Add </del>&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;6 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNaseI buffer&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;3 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNase&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;Store at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;75°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This is to heat-inactivate the enzyme.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;</div></td><td class='diff-marker'>+</td><td style="background: #cfc; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;RNase-free water&lt;/li&gt;&lt;li&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaseI buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNase&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Incubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Prepare template DNA&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;font color = &quot;red&quot;&gt;&lt;i&gt;Generate linearized template via PCR. Do a 100 <ins class="diffchange diffchange-inline">?L </ins>reaction using VF2 and VR.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Can be done once, frozen and reused.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 1: Preincubate repressor and DNA&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Measure out &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;repressor&lt;/font&gt; into reaction tube <ins class="diffchange diffchange-inline">(1)</ins>.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Do the same for relevant controls.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;room temperature&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 hrs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction <ins class="diffchange diffchange-inline">in reaction tube (2)</ins>:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;repressor-DNA mixture&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;22 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;(or)&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 2: Set up transcription reaction&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction <ins class="diffchange diffchange-inline">in reaction tube (2)</ins>:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;DNase treatment (Optional)&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This step hasn't been tried.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;An optional step is to treat the reaction with RNase free DNaseI to remove the template DNA.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;<ins class="diffchange diffchange-inline">Measure out </ins>&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;6 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNaseI buffer&lt;/font&gt; <ins class="diffchange diffchange-inline">into reaction tube (2)</ins>.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;3 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNase&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;Store at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;75°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This is to heat-inactivate the enzyme.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol<ins class="diffchange diffchange-inline">&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;TOTAL TIME REQUIRED FOR THE COMPLETION OF THE PROTOCOL :&lt;font color=#357EC7&gt;~ 3 hrs, 10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/p</ins>&gt;</div></td></tr> <tr><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;/html&gt;</div></td><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;/html&gt;</div></td></tr> <!-- diff generator: internal 2013-05-20 00:42:37 --> </table>

Vaishnavi Ananth http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:In_vitro_transcription_protocol&diff=357149&oldid=prev 2009-10-09T06:31:27Z

<p></p> <table style="background-color: white; color:black;"> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <col class='diff-marker' /> <col class='diff-content' /> <tr valign='top'> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">←Older revision</td> <td colspan='2' style="background-color: white; color:black;">Revision as of 06:31, 9 October 2009</td> </tr> <tr><td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td> <td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td></tr> <tr><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;</div></td><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;html&gt;</div></td></tr> <tr><td class='diff-marker'>-</td><td style="background: #ffa; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;RNase-free water&lt;/li&gt;&lt;li&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaseI buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNase&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Incubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Prepare template DNA&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;font color = &quot;red&quot;&gt;&lt;i&gt;Generate linearized template via PCR. Do a 100 <del class="diffchange diffchange-inline">?L </del>reaction using VF2 and VR.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Can be done once, frozen and reused.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 1: Preincubate repressor and DNA&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Measure out &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;repressor&lt;/font&gt; into a reaction tube.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Do the same for relevant controls.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;room temperature&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 hrs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;repressor-DNA mixture&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;22 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;(or)&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 2: Set up transcription reaction&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;DNase treatment (Optional)&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This step hasn't been tried.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;An optional step is to treat the reaction with RNase free DNaseI to remove the template DNA.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;6 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNaseI buffer&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;3 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNase&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;Store at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;75°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This is to heat-inactivate the enzyme.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;</div></td><td class='diff-marker'>+</td><td style="background: #cfc; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;RNase-free water&lt;/li&gt;&lt;li&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaseI buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNase&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Incubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Prepare template DNA&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;font color = &quot;red&quot;&gt;&lt;i&gt;Generate linearized template via PCR. Do a 100 <ins class="diffchange diffchange-inline"> µl </ins>reaction using VF2 and VR.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Can be done once, frozen and reused.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 1: Preincubate repressor and DNA&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Measure out &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;repressor&lt;/font&gt; into a reaction tube.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Do the same for relevant controls.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;room temperature&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 hrs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;repressor-DNA mixture&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;22 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;(or)&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 2: Set up transcription reaction&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;DNase treatment (Optional)&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This step hasn't been tried.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;An optional step is to treat the reaction with RNase free DNaseI to remove the template DNA.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;6 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNaseI buffer&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;3 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNase&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;Store at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;75°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This is to heat-inactivate the enzyme.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;</div></td></tr> <tr><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;/html&gt;</div></td><td class='diff-marker'> </td><td style="background: #eee; color:black; font-size: smaller;"><div>&lt;/html&gt;</div></td></tr> <!-- diff generator: internal 2013-05-20 00:42:37 --> </table>

Vaishnavi Ananth http://www.openwetware.org/index.php?title=Knight:In_vitro_transcription_protocol&diff=357146&oldid=prev 2009-10-09T06:18:05Z

<p>New page: &lt;html&gt; &lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;...</p> <p><b>New page</b></p><div>&lt;html&gt;<br /> &lt;h2&gt;Solutions/reagents:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;repressor&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PCR template&lt;/li&gt;&lt;li&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;TCEP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;2.5 mM each NTP&lt;/li&gt;&lt;li&gt;RNase-free water&lt;/li&gt;&lt;li&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaseI buffer&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNase&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Equipment:&lt;/h2&gt;&lt;ul type=&quot;circle&quot;&gt;&lt;li&gt;Incubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Reaction tubes&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;h2&gt;Steps:&lt;/h2&gt;&lt;ol&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;Prepare template DNA&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;font color = &quot;red&quot;&gt;&lt;i&gt;Generate linearized template via PCR. Do a 100 ?L reaction using VF2 and VR.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Can be done once, frozen and reused.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 1: Preincubate repressor and DNA&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Measure out &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;20 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;repressor&lt;/font&gt; into a reaction tube.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;Do the same for relevant controls.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;room temperature&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 hrs&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;repressor-DNA mixture&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;22 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;(or)&lt;p&gt;&lt;b&gt;Option 2: Set up transcription reaction&lt;/b&gt;&lt;ol type=&quot;a&quot;&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Use the following table as a checklist for preparing the reaction:&lt;br&gt;&lt;br&gt;&lt;table border cellpadding=5 rules=all frame=void bordercolor=#357EC7&gt;&lt;thead&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;5X E. coli RNA polymerase transcription buffer&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;TCEP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 mM each NTP&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;PCR template&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;E. coli RNA polymerase holoenzyme&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/thead&gt;&lt;tbody&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;Reaction&lt;/font&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;25 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;0.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;b&gt;&lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;2.5 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;/body&gt;&lt;/table&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;li&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;b&gt;&lt;font size=3&gt;DNase treatment (Optional)&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This step hasn't been tried.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;An optional step is to treat the reaction with RNase free DNaseI to remove the template DNA.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;6 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNaseI buffer&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;3 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;RNase-free water&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Add &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 µl&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; of &lt;font color=#357EC7&gt;DNase&lt;/font&gt;.&lt;br&gt;Incubate at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;37°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;1 hr&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;Store at &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;75°C&lt;/font&gt;&lt;/b&gt; for &lt;b&gt;&lt;font color=#357EC7&gt;10 mins&lt;/font&gt;&lt;/b&gt;.&lt;br&gt;&lt;font color = &quot;#800517&quot;&gt;&lt;i&gt;This is to heat-inactivate the enzyme.&lt;/i&gt;&lt;/font&gt;&lt;br&gt;&lt;/li&gt;&lt;/p&gt;&lt;/ol&gt;<br /> &lt;/html&gt;</div>

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