NanoBio: Golden Gate Cloning: Difference between revisions

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(New page: =Golden Gate Cloning= Protocol for Golden Gate Cloning, CG Optimized Authors: C. Goldbeck 6-25-12, modied CAF 08/01/2012 ==Materials needed:== *BsaI, NEB# R0535, *Antarctic Phosphatase, N...)
 
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==Procedure==
==Procedure==
# Digest and dephosphorylate  plasmid. Use BsaI (NEB# R0535, standard enzyme), NEB buffer 4. Digest with 1 ul of enzyme for 1 hr. 37°C Add 1 ul more of enzyme and digest additional 1 hr. 37°C. Do dephosphorylation of vector during digest using Antarctic Phosphatase (NEB# MO201). Note: This enzyme can be heat inactivated, CIP cannot. Heat inactivate both enzymes 65°C 20 min. Do not purify! Use as is.
# Digest and dephosphorylate  plasmid. Use BsaI (NEB# R0535, standard enzyme), NEB buffer 4. Digest with 1 ul of enzyme for 1 hr. 37°C Add 1 ul more of enzyme and digest additional 1 hr. 37°C. Do dephosphorylation of vector during digest using Antarctic Phosphatase (NEB# MO201). Note: This enzyme can be heat inactivated, CIP cannot. Heat inactivate both enzymes 65°C 20 min. Do not purify! Use as is.
# Bsa No PCR purify - HI
# Phosphorylate and hybridize oligonucleotide inserts.
       
##Polynucleotide Kinase (PNK)
 
##Regular ligation Buffer (not rapid, it contains PEG which causes problems when doing heat inactivation. If you use ligation buffer (vs PNK buffer) it already contains ATP so you don’t need to add that)
       
##Incubate ~1.5 hrs 37oC
       
##Heat inactivate 20 min. 65oC
 
##Add 4ul 0.5 M NaCl per reaction for hybridization.
       
        Place in boiling water bath for 2 min., then remove water bath from heat source (still in the water bath) and allow to cool to room temperature.
       
 
       
 
       
       
 
        Reagent
       
 
        vol/rxn (uL)
 
       
       
 
        10x NEB Buffer 4
       
 
        3
 
       
       
 
        10x Antartic Buffer
       
 
        3
 
       
       
 
        100x BSA
       
 
        0.2
 
       
       
 
        BSAI Regular (10 U/uL)
       
 
        2
 
       
       
 
        Antarctic Phos
       
 
        1
 
       
       
 
        water
       
 
        6.8
 
       
       
       
 
       
 
       
       
 
        DNA
       
 
        14
 
       
       
 
        Master Mix
       
 
        16
 
       
       
 
        total
       
 
        30
 
       
 
        Sum DNA + MM
       
 
        30
 
       
 
        MM Sum
       
 
        16
 
       
 
        Digest 2 hrs, 1 ul/hr
       
 
 
            Oligonucleotide Phosphorylation and Hybridization
 
                Polynucleotide Kinase (PNK)
 
                Regular ligation Buffer (not rapid, it contains PEG which causes problems when doing heat inactivation. If you use ligation buffer (vs PNK buffer) it already contains ATP so you don’t need to add that)
 
                Incubate ~1.5 hrs 37oC
 
                Heat inactivate 20 min. 65oC
 
                Add 4ul 0.5 M NaCl per reaction for hybridization.
 
                Place in boiling water bath for 2 min., then remove water bath from heat source (still in the water bath) and allow to cool to room temperature.
 
                Phosphorylation/Hybridization
               
 
               
               
 
               
               
 
               
 
               
               
 
                Reagent
               
 
                vol/rxn (uL)
 
               
               
 
                100uM Sense Oligo
               
 
                3
 
               
               
 
                100uM Anti-Sense Oligo
               
 
                3
 
               
               
 
                10X Ligase Buffer
               
 
                3
 
               
               
 
                PNK
               
 
                2
 
               
               
 
                water
               
 
                19
 
               
               
 
                total
               
 
                30
 
               
 
                MM
               
 
                24
 
               
 
                Oligo
               
 
                6
 
                    Ligation
 
                        Dilute Hybridized/Phosphorlyslated Oligos 1/200 in water. They are already diluted 1/10 during the previous preparation.
 
                        Prepare 10 ul of diluted Vector:Insert at a ratio  of 1:3 with ~ 100 ng total DNA.
 
                        See example below
 
                       
                       
                       
                       
                       
                       
                       
                       
                       
 
                       
                       
 
                        molar excess
                       
                       
 
                       
 
                        [vector]
                       
                       
                       
 
                        [insert]
                       
                       
 
                        vol. (uL)
                       
 
                        vol. (uL)
                       
 
                        vol. (uL)
                       
 
                        mass
                       
 
                        added
                       
                       
 
                        Total
 
                        vector
                       
 
                        (ng/uL)
                       
 
                        size (bp)
                       
 
                        insert 1
                       
 
                        (ng/uL)
                       
 
                        size (bp)
                       
 
                        vector
                       
 
                        insert 1
                       
 
                        water
                       
 
                        vector
                       
 
                        insert
                       
 
                        ng DNA total
                       
 
                        Volume
 
                        Vector
                       
 
                        105
                       
 
                        11,508
                       
 
                        insert 1
                       
 
                        1.23
                       
 
                        40
                       
 
                        1.00
                       
 
                        1.0
                       
 
                        8.0
                       
 
                        105
                       
 
                        3.4
                       
 
                        106.23
                       
 
                        10.0
 
                                Use NEB T4 ligase kit (NEB# M0202), don’t use quick ligation kit.
 
                                Set up ligation reaction and incubate at room temperature for 20 min.
 
                               
 
                                Master Mix
 
                               
 
                                1X
 
                                Ligation RXN
                               
 
                                ul
 
                                10X NEB Ligation Buffer
                               
 
                                2
 
                                T4 DNA Ligase
                               
 
                                1
 
                                water
                               
 
                                7
 
                               
                               
 
                               
 
                                DNA/Insert Mix
                               
 
                                10
 
                                Master Mix
                               
 
                                10
 
                                Total Volume
                               
 
                                20
 
                               
 
                                    Transformation into Mach I Cells
 
                                        Gently thaw cells on ice
 
                                        For each reaction aliquot 10ul of cells into pre-chilled microfuge tube.
 
                                        Add 0.1 – 2 uL of ligation mixture
 
                                        Incubate 30 min. on ice.
 
                                        Heat shock 42oC 30 sec.
 
                                        Inc on ice 2 min.
 
                                        Add 150 ul SOC media
 
                                        Shake horizontally at 37 oC for 1 hr.
 
                                        Pre-warm plates to 37oC
 
                                        Plate 100 ul / plate
 
                                        Incubate overnight
 
                                    Pick colonies, prepare index plate and set up overnight cultures.
 
                                    Purify plasmids from overnight cultures using a miniprep kit.
 
                                    Do a diagnostic digest
 
                                        For pCcm2 digest with BSA I / BamHI
                                        Use the HF version of the enzymes and you can use buffer 4. This gives you less star activity for BamH1.

Revision as of 10:56, 29 April 2013

Golden Gate Cloning

Protocol for Golden Gate Cloning, CG Optimized Authors: C. Goldbeck 6-25-12, modied CAF 08/01/2012

Materials needed:

  • BsaI, NEB# R0535,
  • Antarctic Phosphatase, NEB#M0201
  • Polynucleotide kinase, xxx
  • T4 ligase
  • T4 ligase buffer
  • Mach 1 chemically competent cells
  • HF BsaI
  • HF BamHI

Procedure

  1. Digest and dephosphorylate plasmid. Use BsaI (NEB# R0535, standard enzyme), NEB buffer 4. Digest with 1 ul of enzyme for 1 hr. 37°C Add 1 ul more of enzyme and digest additional 1 hr. 37°C. Do dephosphorylation of vector during digest using Antarctic Phosphatase (NEB# MO201). Note: This enzyme can be heat inactivated, CIP cannot. Heat inactivate both enzymes 65°C 20 min. Do not purify! Use as is.
  2. Phosphorylate and hybridize oligonucleotide inserts.
    1. Polynucleotide Kinase (PNK)
    2. Regular ligation Buffer (not rapid, it contains PEG which causes problems when doing heat inactivation. If you use ligation buffer (vs PNK buffer) it already contains ATP so you don’t need to add that)
    3. Incubate ~1.5 hrs 37oC
    4. Heat inactivate 20 min. 65oC
    5. Add 4ul 0.5 M NaCl per reaction for hybridization.
       Place in boiling water bath for 2 min., then remove water bath from heat source (still in the water bath) and allow to cool to room temperature.
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