User:Ana Claudia De O. Manata/Notebook/Aulas TP Bio Molecular/2010/03/16: Difference between revisions

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==Entry title==
===Sequenciação de DNA===
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====Introdução====
 
As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.
 
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica:
[http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html Sanger sequencing ]
 
Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescentes, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação:
[http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html Cycle sequencing]
 
Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.
 
 
====Questões====
 
 
*O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?
É necessária a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (complementar à sequência de DNA a sequenciar), a DNA polimerase e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, G, T, C). Ao mix também são adicionados outro tipo de nucleótidos, os didesoxinucleótidos (ddNTP).
 
 
*Que cadeia é sequenciada?
As cadeias obtidas (com diferenters comprimentos), aquando da sequenciação,  são iguais a porções da cadeia que se quer sequenciar, porque são obtidas a partir de um primer complementar à cadeia molde.
 
 
*Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?
A síntese da cadeia não é continuada indefinitivamente pois na mistura existem pequenas quantidades de ddNTP que bloqueiam a enlongação. Isto deve-se ao facto dos didNTP terem um átomo de Hidrogénio ligado ao carbono 3', em vez do grupo hidroxilo.A
 
 
*Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?
A quantidade de dNTP é bastante maior que a de ddNTP, o que leva a uma incorporação probablística com vantagem dos dNTP, obtendo-se cadeias de diferentes comprimentos e com um número considerável de nucleótidos.
 
 
 
 
 
*Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?
 
[[Image:2010_TP2_1.jpg | 700px]]
 
Podem haver problemas tanto ao nível da polimerização como ao nível da resolução da electroforese. A capacidade de polimerizar fragmentos com mais de 350/400 nucleótidos é reduzida, o que é observado no electroferograma pela fraca intensidade dos picos. Além disto, os picos correspondentes aos fragmentos de menor e maior comprimento não têm uma boa resolução porque na electroforese não são devidamente separados.
 
 
* O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?
Adicionando diferentes primers complementares a diferentes distâncias da cadeia. Quando na sequência estão porções desconhecidas, utiliza-se o final de uma cadeia polimerizada anteriormente para a construção do primer.
 
 
*Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?
 
[[Image:2010_TP2_2.jpg | 700px]]
 
T Vermelho
A Verde
G Preto
C Azul
 
Indivíduo 1: TCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCG
Indivíduo 2: TCGTGTTCTATGAT(C/G)ATGAGAGTCGCCG, heterozigotia
 
 
*Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?
Para sequenciar o gene recorre-se a um procedimento semelhante ao analisado. Quanto à amostra recolhida poderá ser de qualquer tecido uma vez que todas as células têm no genoma este gene.
Para sequenciar o mRNA será necessário obter cDNA, uma vez que só este pode ser sequenciado, e fornecer primers complementares ao mesmo. Quanto à amostra biológica o mais fácil será recolher uma amostra de sangue que contém as células que expressam o gene em questão.
 
 
*Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.
 
 
 
# Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?
# Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.
 
*Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.
 
 
 
====Para pensar====
 
 
*Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?
 
 
*Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?
 




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Sequenciação de DNA

Introdução

As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing

Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescentes, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing

Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.


Questões

  • O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

É necessária a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (complementar à sequência de DNA a sequenciar), a DNA polimerase e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, G, T, C). Ao mix também são adicionados outro tipo de nucleótidos, os didesoxinucleótidos (ddNTP).


  • Que cadeia é sequenciada?

As cadeias obtidas (com diferenters comprimentos), aquando da sequenciação, são iguais a porções da cadeia que se quer sequenciar, porque são obtidas a partir de um primer complementar à cadeia molde.


  • Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

A síntese da cadeia não é continuada indefinitivamente pois na mistura existem pequenas quantidades de ddNTP que bloqueiam a enlongação. Isto deve-se ao facto dos didNTP terem um átomo de Hidrogénio ligado ao carbono 3', em vez do grupo hidroxilo.A


  • Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

A quantidade de dNTP é bastante maior que a de ddNTP, o que leva a uma incorporação probablística com vantagem dos dNTP, obtendo-se cadeias de diferentes comprimentos e com um número considerável de nucleótidos.



  • Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?

Podem haver problemas tanto ao nível da polimerização como ao nível da resolução da electroforese. A capacidade de polimerizar fragmentos com mais de 350/400 nucleótidos é reduzida, o que é observado no electroferograma pela fraca intensidade dos picos. Além disto, os picos correspondentes aos fragmentos de menor e maior comprimento não têm uma boa resolução porque na electroforese não são devidamente separados.


  • O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

Adicionando diferentes primers complementares a diferentes distâncias da cadeia. Quando na sequência estão porções desconhecidas, utiliza-se o final de uma cadeia polimerizada anteriormente para a construção do primer.


  • Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

T Vermelho A Verde G Preto C Azul

Indivíduo 1: TCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCG Indivíduo 2: TCGTGTTCTATGAT(C/G)ATGAGAGTCGCCG, heterozigotia


  • Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?

Para sequenciar o gene recorre-se a um procedimento semelhante ao analisado. Quanto à amostra recolhida poderá ser de qualquer tecido uma vez que todas as células têm no genoma este gene. Para sequenciar o mRNA será necessário obter cDNA, uma vez que só este pode ser sequenciado, e fornecer primers complementares ao mesmo. Quanto à amostra biológica o mais fácil será recolher uma amostra de sangue que contém as células que expressam o gene em questão.


  • Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.


  1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?
  2. Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.
  • Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.


Para pensar

  • Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?


  • Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?



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