User:Ana Claudia De O. Manata/Notebook/Aulas TP Bio Molecular/2010/03/23: Difference between revisions

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===PCR e RT-PCR===
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====Introdução====
 
A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.
 
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica:
[http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html PCR ]
 
Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação:
[http://www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html RT-PCR]
 
Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
 
 
====Questões====
 
*Que características deve ter um primer de PCR?
Comprimento do primer (18 a 22 pb);
Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC;
Conteúdo em GC (40-60%) - Influencia a temperatura de desnaturação;
Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - Estabilidade do terminal;
Não ter estruturas secundárias (e.g. hairpins);
Evitar repetições de nucleótidos;
Evitar homologia cruzada.
 
 
*Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?
 
Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessária; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico.
 
Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagens: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagens: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA.
 
Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA, e não apenas de mRNA, e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.
 
 
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
 
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
 
 
====Nota:====
Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte:
[http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_ep0701.pdf Protocolo Taq polimerase]
[http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_ep0441.pdf Protocolo Transcriptase reversa]
 




Revision as of 05:07, 23 March 2010

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PCR e RT-PCR

Introdução

A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.


Questões

  • Que características deve ter um primer de PCR?

Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - Influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - Estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (e.g. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.


  • Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessária; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico.

Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagens: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagens: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA.

Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA, e não apenas de mRNA, e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.


  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.


Nota:

Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte: Protocolo Taq polimerase Protocolo Transcriptase reversa



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