User:Ana Claudia De O. Manata/Notebook/Aulas TP Bio Molecular/2010/03/23: Difference between revisions
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PCR e RT-PCRIntroduçãoA técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Questões
Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - Influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - Estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (e.g. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.
Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessária; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico. Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagens: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagens: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA. Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA, e não apenas de mRNA, e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.
Recorrendo a um protocolo que inclui a técnica de PCR e posterior sequenciação, e submetendo as amostras de cada um dos indivíduos da família ao procedimento experimental, é possível a identificação das mutações. Procedimento experimental: 1. Design do par de primers que permitam a síntese da região do gene que é transcrita por PCR: a. LEFT primer: CATATTCTGGAGACGCAGGA b. RIGHT primer: TGCTCAAGGCCCTTCATAAT 2. Recolha da amostra biológica - esfregaço de células da mucosa bucal 3. Hidrólise ácida das células para obtenção do DNA 4. Preparar mix para PCR: a. Amostra de DNA b. 2 primers c. Taq polimerase d. dNTPs e. Solução tampão f. Água 5. Realizar PCR e fazer uma electroforese 6. Purificação do DNA, obtido no PCR, para eliminar as sequências correspondentes aos primers 7. Design dos primers que permitam a sequenciação da região do gene que contém as mutações: a. CATATTCTGGAGACGCAGGA (5’ → 3’) b. TGTACACATATTGACCAAATCAGG (5’ → 3’) c. ATGGGACGCTTGATGTTTTC (5’ → 3’) d. GGCATAAAAGTCAGGGCAGA (5’ → 3’) 8. Preparar mix para sequenciação: a. DNA template b. Primers c. DNA polimerase d. dNTP (A, T, C e G) e. ddNTP 9. Análise dos resultados – comparar os resultados da sequenciação com a sequência de referência (BLAST)
Para estudar a expressão do gene poderá recorrer-se à técnica de RT-PCR. Pela acção da enzima transcriptase reversa, a partir do mRNA, presente em cada indivíduo, obtém-se cDNA, que é estudado quantitativa e qualitativamente, comparando sequências obtidas com as sequências sem mutação. Procedimento experimental: 1. Design dos primers para a reacção de RT: b. RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC 2. Recolha da amostra biológica - sangue 3. Lise dos eritrócitos para obtenção do RNA (e sua preparação) 4. Preparar mix para reacção de RT: a. RNA desnaturado b. Solução tampão c. dNTPs d. MgCl2 e. Primers f. Transcriptase reversa g. Água 5. Design dos primers para a reacção de PCR: a. LEFT primer: TCTGTCCACTCCTGATGCTG b. RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC 6. Preparar mix para PCR: a. cDNA b. Solução tampão c. Taq polimerase d. 2 primers e. dNTPs f. Água 7. Realizar PCR e fazer uma electroforese 8. Análise dos resultados Nota:Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte: Protocolo Taq polimerase Protocolo Transcriptase reversa
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