User:Ana Claudia De O. Manata/Notebook/Aulas TP Bio Molecular/2010/04/27: Difference between revisions
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O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. | O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. | ||
#Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. | #Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. | ||
Ddel-1_______________Ddel-2_____________________Ddel-3 | Ddel-1_______________Ddel-2_____________________Ddel-3 (gene normal) | ||
#|________________X______________________| | #|________________X______________________| (gene mutado) | ||
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Digestão de DNA com enzimas de restriçãoAs enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível. As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica. Existem comercializadas perto de 100 enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma sequência única de nucleótidos. As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo, EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E). espécie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd. Exercício 1 – Extremidades e ligaçõesConsidere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição (o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT
São todas sequências palindrómicas.
Bam HI: ---------G GATCC--- ---------CCTAG G--- Hae II: ---------GG CC--- ---------CC GG--- Eco RI: ---------G AATTC--- ---------CTTAA G--- Bgl II: ---------A GATCT--- ---------TCTAG A---
Uma vez que a sequencia de reconhecimento da Bam HI é maior que a da Hae II e, assim, a probabilidade de um GGATCC ocorrer no genoma é menor que GGCC. Portanto, os fragmentos resultantes da digestão com Bam HI são maiores.
Exercício 2 – Mapas de restriçãoAs enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose.
Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
Correspondem a corantes de electroforese. Permitem ver a colocação da amostra nos poços e seguir o desenvolvimento da electroforese.
Esperados: 4 para PleI; 3 para BgII Observados: 3 para PleI; 3 para BgII A gama de separação da electroforese é variável e não permite separar fragmentos com número próximo de nucleótidos.
A concentração de agarose está relacionada com o tamanho da malha do gel, logo com maior concentração de agarose é possível uma separação mais eficiente de fragmentos com menores diferenças de número de nucleótidos.
Usando o marcador de pesos moleculares, procederia à realização de uma recta de calibração com o logaritmo do peso molecular dos fragmentos em função do tempo de retenção. Com o tempo de retenção dos fragmentos digeridos, conseguiria estimar o peso molecular de cada um deles.
Sim, uma vez que a enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 posições e no resultado da electroforese observam-se 6 bandas. Além disso, a distribuição das bandas no resultado da electroforese é consistente com os tamanhos dos fragmentos resultantes da acção de restrição da enzima EcoRI.
Ambas as bandas têm igual número de moléculas de DNA. Considerando que o DNA lambda tem 31.6x10^5 daltons e que 1 dalton = 1.66x10^-27 gramas, o DNA lambda terá aproximadamente 10^-21 gramas = 10^-15 microgramas. Portanto, em 1 micrograma de DNA há aproximadamente 10^15 moléculas de DNA.
Na primeira banda há 0.44 microgramas. Na última banda há 0.073 microgramas.
nt0; nt5000 - Corte pela EcoRI; nt5500 - Corte pela HindIII; nt8000 - Corte pela EcoRI; nt10000. Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:
(ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA
GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC
AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG
CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC
TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT
CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA
CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA
CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT
GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA
AAAAAAAAA) Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutaçõesAs variações de sequência do genoma humano podem resultar na alteração de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense. Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença. O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.
Ddel-1_______________Ddel-2_____________________Ddel-3 (gene normal) #|________________X______________________| (gene mutado)
Utilizando a técnica de PCR é possível amplificar o DNA em questão. Após o PCR procederia a um tratamento do DNA com a enzima de restrição DdeI, seguido de electroforese.
Indivíduo saudável: 2 bandas; Portador: 3 bandas; Doente: 1 banda.
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