User:Ana Isabel F. Simoes/Notebook/Ana Simoes-biomol/2010/05/04: Difference between revisions
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Digestão de DNA com enzimas de restrição | Digestão de DNA com enzimas de restrição | ||
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E H E | |||
O primeiro fragmento (5000) resulta do primeiro corte feito pela enzima EcoRI. | |||
O segundo fragmento (500) resulta do primeiro corte feito pela enzima EcoRI e do corte feito pela enzima HindIII. | |||
O terceiro fragmento (1500) resulta do corte realizado pela enzima HindIII e do segundo corte feito pela EcoRI. | |||
O ultimo fragmento (3000)resulta do segundo corte realizado pela EcoRI. | |||
Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: | Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: | ||
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O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. | O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. | ||
Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR. Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico). | |||
Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. | |||
Gene normal: 2 fragmentos (175 bp, 201bp) | |||
Gene mutado: 1 fragmento (376 bp) - homorozigótico | |||
3 fragmentos (175 bp, 201 bp, 376 bp) - heterozigótico | |||
Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR. | |||
Para diagnosticar a mutação iria proceder a um PCR com a enzima DdeI, que em casos normais cortaria no local da mutação. | |||
Após uma electroforese, com base no número de fragmentos obtidos, determinaria sehavia mutação ou não. | |||
Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico). | |||
Revision as of 03:51, 4 May 2010
Project name | <html><img src="/images/9/94/Report.png" border="0" /></html> Main project page <html><img src="/images/c/c3/Resultset_previous.png" border="0" /></html>Previous entry<html> </html>Next entry<html><img src="/images/5/5c/Resultset_next.png" border="0" /></html> |
As enzimas de restrição são o bisturi dos biologistas moleculares pois permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível. As enzimas de restrição fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. As enzimas de restrição usadas em biologia molecular têm a grande vantagem de clivarem apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica. Existem comercializadas perto de 100 enzimas de restrição, cada uma das quais reconhece e cliva uma sequência única de nucleótidos. As enzimas de restrição identificam-se por uma nomenclatura própria. Por exemplo, EcoRI refere-se à primeira (I) enzima isolada do género Escherichia (E). espécie coli (co), estirpe RY13 (R) e Hind III à terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd. [edit] Exercício 1 – Extremidades e ligações Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT
(3') (5') Bam HI : -----G GATCC------------ -----CCTAG G------------ Hae II: -----GG CC------------ -----CC GG------------ Eco RI: -----G AATTC------------ -----CTTAA G------------ Bgl II: -----A GATCT------------ -----TCTAG A------------ É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? É possivel ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por bam HI uma vez que a sequência CTAG é complementar a GATC, sendo também possivel a ligação com extremidades cortadas por Bgl II, já que a sequência CTAG é complementar a GATCT.
Os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II, uma vez que existe maior probabilidade de encontrar a seguencia GG|CC no genoma do que a G|GATCC, e como tal a Bam HI tem menor probabilidade de encontrar a sua sequência, originando fragmentos maiores.
As enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose. Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
As bandas azuis no gel correspondem a fragmentos de DNA resultantes da acção das enzimas de restrição, migrando no gel de acordo com o seu tamanho (fragmentos maiores migram menos).
Com PleI espera-se 4 fragmentos e com BglI espera-se 3 fragmentos. Com PleI observa-se 3 fragmentos e com BglI obeserva-se 3 fragmentos. Como o gel se encontra concentrado não se consegue separar da melhor forma os fragmentos, pois dois deles estão sobrepostos.
Consoante o tamanho dos fragmentos de restrição devemos variar a concentração de agarose. Assim, quanto mais pequenos forem os fragmentos mais concentrado deverá ser o gel, uma vez que estes por serem mais leves migram mais, correndo o risco de migrarem para fora do gel.
A determinação rigorosa do tamanho dos fragmentos de DNA faz-se por medição da distância entre o ponto de aplicação do DNA no gel e o local onde se depositam os fragmentos. Uma vez que a distância percorrida é proporcional ao tamanho do fragmento, iremos construir uma curva de calibração, e através do valor da distância percorrida pelo fragmento iremos determinar o tamanho do fragmento.
Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel? Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?
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