User:Ana Luisa Van Innis/Notebook/Caderno BioMol/2010/03/16: Difference between revisions
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'''Sequenciação de DNA''' | '''Sequenciação de DNA''' | ||
'''Introdução''' | '''Introdução''' | ||
As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger. | As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger. |
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Sequenciação de DNA
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: Sanger sequencing Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação: Cycle sequencing Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático. *O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? Para uma reacçao de sequenciaçao é necessário: -Primer -dNTP's e ddNTP's -DNA polymerase -DNA a sequenciar *Que cadeia é sequenciada? A cadeia sequenciada é que é usada como molde pelo primer. *Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação? Devido à utilização de ddNTPs (nucleotidos modificados que não possuem OH 3') a elongação é terminada (stop da elongação), isto é, o nucleotido seguinte não poderá ligar-se (não há formação da ligação fosfodiester).
*Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo? Os dNTPS são nucleotidos que emparelharem e que possuem o grupo OH 3' permitindo a formação da ligação fosfodiester com o nucleotido seguinte.
*Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? -Sobreposição de picos(picos mal definidos) Má resolução devio a limitações técnicas da electroforese. -Diminuição da intensidade devido a menor probabilidade de sintetizar fragmentos maiores do que a probabilidade de sintetizar fragmentos menores.
* O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo? Para proceder a sequenciação o fragmento completo podemos usar o metodo do primer walking: 1- Usa-se um primer que emparelha com o inicio da sequencia do DNA, de forma a sintetizar um fragmento adjacente à sequencia desconhecida. 2-o fragmento de DNA sintezindo é sequenciado ao usar o metodo de terminaçao. 3-o final da cadeia sintetizada é usada como primer para o fragmento seguinte(assim sucessivamente atá sequenciar o fragmento completo) *Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo? Individuo 1 - TCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCG Individuo 2 - TCGTGTTCTATGATGATGAGAGTCGCCG
*Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder? Conhecendo o gene, utilisa-se um primer complementar e sequencia-se o gene. Com o mRNA é necessário isolar em primeiro a molecula, em seguida faz-se transcrição reversa (utilizando a transcriptase reversa). Obtem-se assim o cDNA, e para iniciar a sequenciação usa-se um primer complemtar ao cDNA. *Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1. * Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo? * Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Jstifique. *Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas. Para pensar
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