User:Filipa Ribeiro C. Lucas/Notebook/Filipa Lucas/2010/04/27: Difference between revisions
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== Exercício 1 – Extremidades e ligações == | |||
Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): | |||
Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT | |||
Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? | |||
Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. | |||
É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? | |||
Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. | |||
== Exercício 2 – Mapas de restrição == | |||
A que correspondem as bandas azuis no gel? | |||
Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? | |||
Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? | |||
Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo? | |||
Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima. | |||
Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? | |||
Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: | |||
Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel? | |||
Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas? | |||
Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII: | |||
DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000 | |||
DNA x HindIII = 5500 + 4500 | |||
DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500 | |||
Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula. | |||
Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique: | |||
uma enzima de corte único; | |||
uma enzima com dois cortes; | |||
uma enzima que não corta neste DNA. | |||
== Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações == | |||
As variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense. | |||
Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença. | |||
O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. | |||
Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. | |||
Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR. | |||
Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico). |
Revision as of 16:08, 10 May 2010
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Exercício 1 – Extremidades e ligaçõesConsidere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.
Exercício 2 – Mapas de restriçãoA que correspondem as bandas azuis no gel? Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo? Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima. Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel? Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?
Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutaçõesAs variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense. Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença. O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI. Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI. Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR. Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico). |