User:Ines Sofia Silva Vieira/Notebook/Bio Molec - caderno/2010/03/23: Difference between revisions
(Autocreate 2010/03/23 Entry for User:Ines_Sofia_Silva_Vieira/Notebook/Bio_Molec_-_caderno) |
|||
| Line 6: | Line 6: | ||
| colspan="2"| | | colspan="2"| | ||
<!-- ##### DO NOT edit above this line unless you know what you are doing. ##### --> | <!-- ##### DO NOT edit above this line unless you know what you are doing. ##### --> | ||
== | ==TP4== | ||
PCR e RT-PCR | |||
[edit] Introdução | |||
A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. | |||
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR | |||
Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR | |||
Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção. | |||
[edit] Questões | |||
Que características deve ter um primer de PCR? | |||
Um primer corresponde a um fragemnto de DNA de 15-30 nucleotidos com um conteudo elevado em GC(40-60%). Numa reacção de PCR existem dois primers(Forward e Reverse) ligados à terminação 3' complementar a cada uma das cadeia simples de DNA. A ligação dos primers À cadeia ocorre a temperaturas entre 50 e 65ºC. | |||
Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam? | |||
O primer específico de gene deve ser utilizado quando pretendemos obter fragmentos de DNA específicos do gene que está a ser estudado. Por exemplo, no caso de uma mutação génica este método facilmente nos permite identificar essa alteração nos genes. Este método contudo não é muito adequado quando pretendemos sequenciar diferentes fragmentos de DNA. | |||
O primer oligo-dT é util quando se pretende transcrever fragmentos de mRNA com cauda de poli-A, não sendo adequado quando se quer obter fragmentos de DNA de outras regiões sem esta terminação. | |||
O primer Random tem a vantagem de poder ser utilizado para transcrever diferentes regiões e tipos de RNA uma vez que são utilizados diferentes primers permitindo-nos sequenciar a região terminal da cadeia que pela utilização de um unico primer seria dificil. Possui como desvantagem o facto de não ser específico para quando queremos transcrever sequências específicas e o facto de transcrever demasiados fragmentos de RNA. | |||
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. | |||
Para identificar uma mutação no DNA. DETALHE LABORATORIAL. | |||
Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. | |||
Revision as of 05:01, 23 March 2010
 Project name
|
<html><img src="/images/9/94/Report.png" border="0" /></html> Main project page <html><img src="/images/c/c3/Resultset_previous.png" border="0" /></html>Previous entry<html> </html>Next entry<html><img src="/images/5/5c/Resultset_next.png" border="0" /></html> |
TP4PCR e RT-PCR [edit] Introdução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam? O primer específico de gene deve ser utilizado quando pretendemos obter fragmentos de DNA específicos do gene que está a ser estudado. Por exemplo, no caso de uma mutação génica este método facilmente nos permite identificar essa alteração nos genes. Este método contudo não é muito adequado quando pretendemos sequenciar diferentes fragmentos de DNA. O primer oligo-dT é util quando se pretende transcrever fragmentos de mRNA com cauda de poli-A, não sendo adequado quando se quer obter fragmentos de DNA de outras regiões sem esta terminação. O primer Random tem a vantagem de poder ser utilizado para transcrever diferentes regiões e tipos de RNA uma vez que são utilizados diferentes primers permitindo-nos sequenciar a região terminal da cadeia que pela utilização de um unico primer seria dificil. Possui como desvantagem o facto de não ser específico para quando queremos transcrever sequências específicas e o facto de transcrever demasiados fragmentos de RNA. Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Para identificar uma mutação no DNA. DETALHE LABORATORIAL.
| |
