User:Ines Sofia Silva Vieira/Notebook/Bio Molec - caderno/2010/05/11: Difference between revisions
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Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. | Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. | ||
Cópias de gene extraídas de uma pessoa: 2*10^13 | |||
cópias de plasmideo: 1000*5*10^9*700 = 35*10^14 | |||
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Escolheria um vector B uma vez que tem promotor o que permite a transcrição de uma proteina humana. | Escolheria um vector B uma vez que tem promotor o que permite a expressão genética e a transcrição de uma proteina humana. | ||
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3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? | 3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? | ||
Introduziria a sequência no local de policlonagem na zona de BamHI. Como a sequência a introduzir possui as extremidades iguais, existe possibilidade da introdução | Introduziria a sequência no local de policlonagem na zona de BamHI. Como a sequência a introduzir possui as extremidades iguais, existe possibilidade da introdução ocorrer no local errado ou no sentido inverso ocorrendo uma troca na ligação às extremidades podendo mesmo o fragmento não ser inserido. | ||
3.2 Como procederia para resolver o problema? | 3.2 Como procederia para resolver o problema? | ||
A resoluçao do problerma poderia ser feita através da | A resoluçao do problerma poderia ser feita através da análise de vários vectores introduzidos na célula. Assim, para garantir que o fragmento é introduzido no sentido correcto, iremos proceder ao corte da sequência com a enzima KpnI e EcoRI e ver qual o tamanho do fragmento(procedendo por exemplo a uma electroforese). Os fragmentos obtidos têm assim tamanhos distintos permitindo-nos verificar se a sequência se encontra presente e se está no sentido que pretendemos. Se o fragmento tiver sido inserido no local correcto obtemos uma banda com 800pb e outra com 4500pb. Se o fragmento tiver sido inserido no sentido inverso as bandas têm 120pb e 5510pb enquanto que quando não há introdução do fragmento verifica-se apenas uma banda com 4700pb. | ||
Uma forma simples de resolução do problema para evitar a má inserção do vector por ter extremidades iguais, seria a adição de uma extremidade EcoRI ao fragmento. | |||
3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido. | 3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido. | ||
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Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? | Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? | ||
A clonagem funcionou pois na pista 3 conseguimos observar dois fragmentos, um de 800pb e outro de 4500pb. Pela resposta à questão 3.2, sabemos que estes são os fragmentos que comprovam uma inserção correcta. | |||
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Revision as of 17:23, 17 May 2010
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TP8[edit] Questões 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. Cópias de gene extraídas de uma pessoa: 2*10^13 cópias de plasmideo: 1000*5*10^9*700 = 35*10^14 2. Considere os seguintes vectores: 2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem?
Introduziria a sequência no local de policlonagem na zona de BamHI. Como a sequência a introduzir possui as extremidades iguais, existe possibilidade da introdução ocorrer no local errado ou no sentido inverso ocorrendo uma troca na ligação às extremidades podendo mesmo o fragmento não ser inserido.
Uma forma simples de resolução do problema para evitar a má inserção do vector por ter extremidades iguais, seria a adição de uma extremidade EcoRI ao fragmento. 3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido. Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? A clonagem funcionou pois na pista 3 conseguimos observar dois fragmentos, um de 800pb e outro de 4500pb. Pela resposta à questão 3.2, sabemos que estes são os fragmentos que comprovam uma inserção correcta. |
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