User:Leonor Quintaneiro/Notebook/Aulas de BioMol/2010/03/23
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PCR e RT-PCRIntrodução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Que características deve ter um primer de PCR?. Um primer deve ser complementar à sequência de DNA quer pretendemos analisar, deve também ter um comprimento de cerca de 20 nucleótidos para que não haja o perigo deste se ligar a uma outra sequência de DNA que também seja semalhante (no caso de um primer mais curto) e, no caso de um primer muito comprido há o perigo deste não se vir a ligar com a sequência que pretendemos. Outra característica importante dos primers é o ratio de nucleótidos G's e C's face aos A's e T's: visto que as ligações entre G's e C's são de três pontes de hidrogénio estas vão ser mais fortes e, por isso, terá de se ter em atenção que este fenómeno pode levar o primer a ligar-se a uma sequência que não seja a que pretendemos e que não seja totalmente complementar. Por este motivo um primer deverá ter uma percentagem de 40-50% de G's e C's. Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam? Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família
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