User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/03/16: Difference between revisions

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===Sequenciação de DNA===
===Aula TP3: Sequenciação de DNA===




====Introdução====
====Questões====


As sequências de genes e mRNAs com que temos vindo a trabalhar foram obtidas experimentalmente com base na técnica de sequênciação de DNA desenvolvida nos anos 70 por Fred Sanger.


A seguinte animação explica o funcionamento da técnica:
*O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?
[http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html Sanger sequencing ]


Actualmente utiliza-se uma versao mais moderna que recorre a DNA polimerases termoestáveis e nucleótidos fluorescents, permitindo maior sensibilidade e a leitura automática do resultado da sequênciação:
É necessária uma amostra do DNA a sequenciar, um primer complementar à sequencia desse DNA, Taq DNA polimerase, uma mistura de desoxiribonucleótidos (dNTP) e di-desoxiribonucleótidos. Consoante o mºetodo utilizado, estes poderão ser fluorescentes (cada um ligado a um fluorocromo distinto) ou não. Neste caso, o primer ou um dos dNTPs terá de ser marcado (com radioactividade ou fluorescência) de forma a permitir a detecção fácil da nova cadeia sintetizada.
[http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html Cycle sequencing]


Note que o resultado de uma sequenciação é um electroferograma, que depois é convertido em "As, Cs, Gs e Ts" por um programa informático.


*Que cadeia é sequenciada?


====Questões====
A reacção permite determinar a sequência da cadeia que é idêntica ao primer.


*Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?


*O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?
Porque a determinação da ordem de nucleótidos presente na cadeia de DNA é conseguida através da terminação forçada da síntese de DNA pela Taq DNA polimerase em resultado da incorporação de um didesoxinucleótido. A identificação sucessiva do nucleótido terminador permite deduzir a sequência da cadeia de DNA.
 
*Que cadeia é sequenciada?
 
*Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?


*Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?
*Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?


 
Porque os didesoxinucleótido terminadores são incluídos na reacção com uma concentração muito baixa relativamente aos nucleótidos normais, tornando a sua incorporação totalmente aleatória e garantindo uma igual probabilidade de terminação em qualquer dos nucleótidos da cadeia de DNA a sequenciar.




*Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?
*Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?


[[Image:2010_TP2_1.jpg | 700px]]


* O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?
* O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

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Aula TP3: Sequenciação de DNA

Questões

  • O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

É necessária uma amostra do DNA a sequenciar, um primer complementar à sequencia desse DNA, Taq DNA polimerase, uma mistura de desoxiribonucleótidos (dNTP) e di-desoxiribonucleótidos. Consoante o mºetodo utilizado, estes poderão ser fluorescentes (cada um ligado a um fluorocromo distinto) ou não. Neste caso, o primer ou um dos dNTPs terá de ser marcado (com radioactividade ou fluorescência) de forma a permitir a detecção fácil da nova cadeia sintetizada.


  • Que cadeia é sequenciada?

A reacção permite determinar a sequência da cadeia que é idêntica ao primer.

  • Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

Porque a determinação da ordem de nucleótidos presente na cadeia de DNA é conseguida através da terminação forçada da síntese de DNA pela Taq DNA polimerase em resultado da incorporação de um didesoxinucleótido. A identificação sucessiva do nucleótido terminador permite deduzir a sequência da cadeia de DNA.

  • Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

Porque os didesoxinucleótido terminadores são incluídos na reacção com uma concentração muito baixa relativamente aos nucleótidos normais, tornando a sua incorporação totalmente aleatória e garantindo uma igual probabilidade de terminação em qualquer dos nucleótidos da cadeia de DNA a sequenciar.


  • Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?


  • O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?


  • Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?


  • Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?
  • Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.
  1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?
  2. Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.
  • Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.


Para pensar

  • Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?


  • Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?



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