User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/04/27: Difference between revisions
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1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? | |||
Trata-se de uma sequência "palindrómica", ou seja, quando lidas na direcção 5'-3', ambas as cadeias da molécula de DNA apresentam exactamenta a mesma sequência de nucleótidos. | Trata-se de uma sequência "palindrómica", ou seja, quando lidas na direcção 5'-3', ambas as cadeias da molécula de DNA apresentam exactamenta a mesma sequência de nucleótidos. | ||
2. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. | |||
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3. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? | |||
É possível ligar extremidades geradas por Bam HI entre si, mas também com extremidades geradas pro BglII, uma vez que os nucleótidos desemparelhados são compatíveis. | É possível ligar extremidades geradas por Bam HI entre si, mas também com extremidades geradas pro BglII, uma vez que os nucleótidos desemparelhados são compatíveis. | ||
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4. Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique. | |||
A digestão do genoma com BamHI deve gerar fragmentos de maiores dimensões, visto que o local de corte desta enzima tem menor probabilidade de surgir (6 nucleótidos vs 4 nucleótidos do local HaeII). Assim sendo, a enzima irá cortar o genoma um número menor de vezes e, logo, gerar fragmentos de maiores dimensões. | A digestão do genoma com BamHI deve gerar fragmentos de maiores dimensões, visto que o local de corte desta enzima tem menor probabilidade de surgir (6 nucleótidos vs 4 nucleótidos do local HaeII). Assim sendo, a enzima irá cortar o genoma um número menor de vezes e, logo, gerar fragmentos de maiores dimensões. |
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Enzimas de restriçãoExercício 1 – Extremidades e ligaçõesConsidere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT 1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? Trata-se de uma sequência "palindrómica", ou seja, quando lidas na direcção 5'-3', ambas as cadeias da molécula de DNA apresentam exactamenta a mesma sequência de nucleótidos. 2. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas. 3. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? É possível ligar extremidades geradas por Bam HI entre si, mas também com extremidades geradas pro BglII, uma vez que os nucleótidos desemparelhados são compatíveis. No entanto, não é possível ligar extremidades geradas por BamHI e EcoRI.
A digestão do genoma com BamHI deve gerar fragmentos de maiores dimensões, visto que o local de corte desta enzima tem menor probabilidade de surgir (6 nucleótidos vs 4 nucleótidos do local HaeII). Assim sendo, a enzima irá cortar o genoma um número menor de vezes e, logo, gerar fragmentos de maiores dimensões. Exercício 2 – Mapas de restriçãoAs enzimas de restrição podem ser usadas para criar um mapa físico de uma molécula de DNA, reflectindo a sequência subjacente. Para isso, o fragmento de DNA a caracterizar é digerido com duas ou mais enzimas de restrição e analisado por electroforese em gel de agarose.
Reveja os conceitos associados à electroforese em gel de agarose e veja um exemplo virtual da sua aplicação em http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
Os produtos de digestão do genoma do bacteriófago lambda (de 48510 pares de bases) são muito utilizados como marcadores de tamanhos moleculares em electroforeses de DNA. A enzima EcoRI corta o genoma do fago em 5 locais: 21227, 26106, 31749, 39175, 44980. Considere o resultado de uma electroforese apresentado em cima.
(ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGA
GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC
AG|GCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATG
CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGC
TCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGAT
CCTGAGAACTTCAG|GCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA
CCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCA
CTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACT
GGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAAA
AAAAAAAAA) Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutaçõesAs variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense. Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença. O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.
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