User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/04/27: Difference between revisions
| Line 38: | Line 38: | ||
===Exercício 2 – Mapas de restrição=== | ===Exercício 2 – Mapas de restrição=== | ||
1. A que correspondem as bandas azuis no gel? | |||
Aos corantes de electroforese usados para tornar visível a amostra durante a aplicação e para vizualisar a frente de migração. | |||
2. Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê? | |||
3. Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição? | |||
A concentração de agarose impõe diferentes restrições à migração das moléculas de DNA no gel e vai determinar que gamas de tamanho vão apresentar um comportamento linear na separação. Concentrações demasiado altas impedem a migração de moléculas muito grandes, que não conseguem entrar no gel. Concentrações muito baixas não vão impôr restrições à migração de moléculas pequenas, que vão comportar-se de igual forma na electroforese. Assim, para cada gama de tamanhos a analisar é necessário escolher a concentração de agarose apropriada. | |||
4. Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo? | |||
Utilizando uma mistura de fragmentos de DNA de tamanho conhecido (marcador) posso gerar uma recta de calibração em que relaciono a distância migrada (em cm) com o tamanho da molécula. Depois só tenho de medir a distância migrada pelos meus fragmentos desconhecidos e deduzir o seu tamanho a partir da recta. | |||
#Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? | #Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê? | ||
#Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: | #Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: | ||
| Line 67: | Line 72: | ||
# uma enzima com dois cortes; | # uma enzima com dois cortes; | ||
#uma enzima que não corta neste DNA.<br> | #uma enzima que não corta neste DNA.<br> | ||
===Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações=== | ===Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações=== | ||
Revision as of 08:15, 14 June 2010
 Project name
|
<html><img src="/images/9/94/Report.png" border="0" /></html> Main project page <html><img src="/images/c/c3/Resultset_previous.png" border="0" /></html>Previous entry<html> </html>Next entry<html><img src="/images/5/5c/Resultset_next.png" border="0" /></html> |
Enzimas de restriçãoExercício 1 – Extremidades e ligaçõesConsidere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada): Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT 1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas? Trata-se de uma sequência "palindrómica", ou seja, quando lidas na direcção 5'-3', ambas as cadeias da molécula de DNA apresentam exactamenta a mesma sequência de nucleótidos. 2. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.
3. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII? É possível ligar extremidades geradas por Bam HI entre si, mas também com extremidades geradas pro BglII, uma vez que os nucleótidos desemparelhados são compatíveis. No entanto, não é possível ligar extremidades geradas por BamHI e EcoRI.
A digestão do genoma com BamHI deve gerar fragmentos de maiores dimensões, visto que o local de corte desta enzima tem menor probabilidade de surgir (6 nucleótidos vs 4 nucleótidos do local HaeII). Assim sendo, a enzima irá cortar o genoma um número menor de vezes e, logo, gerar fragmentos de maiores dimensões. Exercício 2 – Mapas de restrição1. A que correspondem as bandas azuis no gel? Aos corantes de electroforese usados para tornar visível a amostra durante a aplicação e para vizualisar a frente de migração. 2. Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?
A concentração de agarose impõe diferentes restrições à migração das moléculas de DNA no gel e vai determinar que gamas de tamanho vão apresentar um comportamento linear na separação. Concentrações demasiado altas impedem a migração de moléculas muito grandes, que não conseguem entrar no gel. Concentrações muito baixas não vão impôr restrições à migração de moléculas pequenas, que vão comportar-se de igual forma na electroforese. Assim, para cada gama de tamanhos a analisar é necessário escolher a concentração de agarose apropriada.
Utilizando uma mistura de fragmentos de DNA de tamanho conhecido (marcador) posso gerar uma recta de calibração em que relaciono a distância migrada (em cm) com o tamanho da molécula. Depois só tenho de medir a distância migrada pelos meus fragmentos desconhecidos e deduzir o seu tamanho a partir da recta.
Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutaçõesAs variações de sequência do genoma humano podem resultar na alterção de locais de corte de enzimas de restrição. As bandas polimórficas observadas após a electroforese de amostras de DNA genómico após tratamento com enzimas de restrição (RFLPs) constituíram o primeiro método laboratorial de “impressões digitais” de DNA para identificação de indivíduos em Medicina legal e forense. Da mesma forma, mutações causadoras de doença podem gerar variações nos locais de corte de enzimas de restrição que permitem um fácil diagnóstico da sua presença. O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.
| |
