User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/23: Difference between revisions

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*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
É possível identificar mutações presentes no gene em questão recorrendo à técnica de PCR e posterior sequênciação. O procedimento experimental deve ser aplicado a cada um dos indivíduos da família para uma comparação final que permite, então, a identificação das mutações.
1) Amostra biológica: células da mucosa bucal – esfregaço -> hidrólise ácida das células.
2) Design dos primers que permitam amplificar a cadeia (PCR)
OLIGO                    start  len      tm      gc%  any          3'      rep          seq
LEFT PRIMER        118    20  58.82  50.00    4.00    1.00    10.00      CATATTCTGGAGACGCAGGA
RIGHT PRIMER      2112  20  59.67  45.00    7.00    3.00    11.00      TGCTCAAGGCCCTTCATAAT
3) PCR (temos falta de material): primer, segmento a amplificar, o q precisamos
Material:
Amostra de DNA;
2 primers (forward e reverse);
Taq polimerase;
Mix de dNTPs;
Tampão;
Água.
4) Purificação do DNA para “limpar” as sequências correspondentes aos primers
5) Design dos primers que permitam a sequenciação
OLIGO              start  len      tm      gc%  any    3'      rep          seq
LEFT PRIMER        118    20  58.82  50.00    4.00    1.00    10.00      CATATTCTGGAGACGCAGGA
600-650
OLIGO            start  len      tm    gc%  any    3'  rep      seq
LEFT PRIMER      1498  24  58.81  37.50  6.00  2.00 12.00 TGTACACATATTGACCAAATCAGG
1000-1200
OLIGO          start  len      tm    gc%  any    3'  rep      seq
LEFT PRIMER      1049  20  59.94  45.00  2.00  0.00 10.00 ATGGGACGCTTGATGTTTTC
1600-1800
OLIGO            start  len    tm    gc%  any    3'  rep      seq
LEFT PRIMER        512  20  60.21  50.00  2.00  2.00 11.00 GGCATAAAAGTCAGGGCAGA
6) Sequenciação:
É necessária a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (que é complementar à sequência de DNA), DNA polimerase (enzima) e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, T, C e G). À mistura também se adiciona outro tipo de nucleótidos, didesoxinucleótidos (ddNTP)
7) Análise de resultados – comparação dos resultados da sequenciação com a sequência referência (BLAST)


*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Revision as of 07:54, 24 May 2010

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PCR e RT-PCR

Introdução

A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por isso o método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.


Questões

  • Que características deve ter um primer de PCR?

Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (ex. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.


  • Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessárias; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico;


Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida com mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagem: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagem: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA;

Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA e não apenas de mRNA e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.


  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.


É possível identificar mutações presentes no gene em questão recorrendo à técnica de PCR e posterior sequênciação. O procedimento experimental deve ser aplicado a cada um dos indivíduos da família para uma comparação final que permite, então, a identificação das mutações.

1) Amostra biológica: células da mucosa bucal – esfregaço -> hidrólise ácida das células.

2) Design dos primers que permitam amplificar a cadeia (PCR)

OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 118 20 58.82 50.00 4.00 1.00 10.00 CATATTCTGGAGACGCAGGA RIGHT PRIMER 2112 20 59.67 45.00 7.00 3.00 11.00 TGCTCAAGGCCCTTCATAAT


3) PCR (temos falta de material): primer, segmento a amplificar, o q precisamos Material: Amostra de DNA; 2 primers (forward e reverse); Taq polimerase; Mix de dNTPs; Tampão; Água.

4) Purificação do DNA para “limpar” as sequências correspondentes aos primers

5) Design dos primers que permitam a sequenciação

OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 118 20 58.82 50.00 4.00 1.00 10.00 CATATTCTGGAGACGCAGGA

600-650 OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 1498 24 58.81 37.50 6.00 2.00 12.00 TGTACACATATTGACCAAATCAGG

1000-1200 OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 1049 20 59.94 45.00 2.00 0.00 10.00 ATGGGACGCTTGATGTTTTC

1600-1800 OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 512 20 60.21 50.00 2.00 2.00 11.00 GGCATAAAAGTCAGGGCAGA


6) Sequenciação: É necessária a cadeia de DNA a sequenciar (DNA template), um primer (que é complementar à sequência de DNA), DNA polimerase (enzima) e os 4 desoxinucleótidos - dNTP (A, T, C e G). À mistura também se adiciona outro tipo de nucleótidos, didesoxinucleótidos (ddNTP)

7) Análise de resultados – comparação dos resultados da sequenciação com a sequência referência (BLAST)



  • Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.



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