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| ==Hobbies== | | ==Hobbies== |
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| *Romantic music(do not confuse with corny music). | | *Romantic classical music. |
| *Soccer. | | *Soccer. |
| *Realism and heroic fantasy books. | | *Realism and heroic fantasy books. |
| | *Reading about the universe. |
| | *Videogames! |
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| ==Education== | | ==Education== |
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| *[[IGEM:UNAM-Genomics Mexico/2009/Notebook/iGEM 2011 H2| Gus' Logbook]] | | *[[IGEM:UNAM-Genomics Mexico/2009/Notebook/iGEM 2011 H2| Gus' Logbook]] |
| *[[User:Eduardo_Vladimir_Munoz/Notebook/UNAM_Genomics_Mexico_2011|Eduardo's Logbook]] | | *[[User:Eduardo_Vladimir_Munoz/Notebook/UNAM_Genomics_Mexico_2011|Eduardo's Logbook]] |
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| ==Protocols used==
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| These are the protocols used by our team,in spanish.
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| Miguel Ángel Ramírez et. al.
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| ===Extracción de ADN genómico===
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| METODO
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| 1. Inocular 5 ml de medio de cultivo con la cepa de interés e incubar 12 hrs a 300 rpm.
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| 2. Centrifugar el cultivo a 10 000 rpm durante 1 min.
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| 3. Resuspender la pastilla celular en 1 ml de TE 50:20, pH=8.0 con ayuda del vortex.
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| [El TE elimina cationes divalentes y lava el exceso de medio de cultivo].
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| 4. Centrifugar a 10 000 rpm durante 1 min y decantar el sobrenadante.
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| 5. Resuspender la pastilla celular en 0.4 ml de TE 50:20 con la ayuda del vortex.
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| 6. Adicionar 50 μl de SDS al 10% y 50 μl de proteinasa K a 2.5 mg/ml. Mezclar por inversión
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| varias veces e incubar a 37 oC durante 1 hr.
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| [El SDS es un detergente que lisa la membrana bacteriana, mientras que la proteinasa K corta
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| proteínas].
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| 7. Transferir el lisado claro a una jeringa con aguja del No. 20 y hacerlo pasar a través de la
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| aguja 5 veces.
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| 8. Repetir la operación anterior pero esta ves usando una aguja del No. 25.
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| [Cuando se hace pasar la solución a través de las agujas se logra romper complejos
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| macromoleculares en los que se encuentra atrapado el DNA. Con esta acción parte del DNA se
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| rompe, aunque el daño no es suficiente para interferir con su análisis].
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| 9. Adicionar 0.5 ml de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24:1) y mezclar con el vortex.
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| [Con esta operación se busca eliminar proteínas. El fenol desnaturaliza a las proteínas y
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| probablemente disuelve proteínas desnaturalizadas. El cloroformo también contribuye a
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| desnaturalizar proteínas además de que estabiliza la interfase entre la solución acuosa y el fenol.
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| La mezcla fenol-clorofomo elimina el agua contenida en la fase orgánica. El alcohol isoamílico
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| ayuda a la separación de la fase orgánica de la acuosa].
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| 10. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min. Recuperar la fase acuosa y repetir la operación
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| anterior 1 vez más.
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| 11. Recuperar la fase acuosa y adicionar 2 volúmenes de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1).
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| [Con este paso se pretende eliminar al fenol debido a que oxida al DNA].
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| 12. Recuperar la fase acuosa y adicionar 1/10 del volumen de acetato de potasio 3 M y 2
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| volúmenes de etanol absoluto. Mezclar con ayuda del vortex y centrifugar a 10 000 rpm y 4 oC
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| durante 10 min.
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| [El DNA es insoluble en etanol y con la ayuda del acetato se favorece la precipitación de los
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| ácidos nucleicos].
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| 13. Retirar el sobrenadante y adicionar 1 ml de etanol al 70 %.
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| [Con el etanol al 70 % se lava el exceso de sal contenida en la muestra].
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| 14. Resuspender con vortex y centrifugar 2 min a temp. ambiente. Repetir una vez más el lavado.
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| 15. Retirar el sobrenadante y secar con ayuda del DNA speed vac.
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| 16. Resuspender en 100 μl de TE-RNAsa (50 μg/ml) y analizar la preparación de DNA en un gel
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| de agarosa al 1 %.
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| ===Extracción de ADN plásmidico===
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| METODO
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| 1. Inocular 3 ml de medio de cultivo con la cepa de interés e incubar 12 hrs a 37 oC y 300 rpm.
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| 2. Transferir 1.5 ml del cultivo a un tubo eppendorf. Centrifugar a máxima velocidad (14 000
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| rpm) durante 1 min.
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| 3. Decantar el sobrenadante y transferir el resto del cultivo al tubo eppendorf del paso anterior.
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| 4. Repetir los pasos 2 y 3. Retirar totalmente el medio de cultivo.
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| [El medio de cultivo deteriora la calidad de la preparación].
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| 5. Resuspender la pastilla celular en 100 μl de Solución I (Glucosa/Tris/EDTA) con ayuda del
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| vortex.
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| [Esta solución isotónica permite separar completamente a las bacterias, además de que
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| contribuye a eliminar los iones divalentes presentes en el medio, mismos que son cofactores de
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| muchas endonucleasas].
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| 6. Adicionar 200 μl de Solución II (NaOH 0.2 N/SDS 1 %). Mezclar por inversión.
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| [El SDS (Dodecilsulfato de sodio) es un detergente que rompe las membranas bacterianas y
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| desnaturaliza proteínas. El NaOH desnaturaliza al cromosoma y a los plásmidos].
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| 7. Adicionar 150 μl de Solución III (CH3COOK 5 M, pH=4.8). Mezclar por inversión.
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| [El acetato neutraliza la solución y favorece el apareamiento de las cadenas de DNA
| |
| anteriormente desnaturalizadas. Para el caso del DNA plasmídico, las hebras rápidamente se
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| aparean y adquieren su configuración natural. En cuanto al DNA cromosomal, la
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| renaturalización es muy ineficiente, lo que provoca que quede atrapado con los restos protéicos.
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| Adicionalmente, el potasio forma complejos con el SDS que a su vez interaccionan con las
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| proteínas formando precipitados en los que queda atrapado el DNA cromosomal].
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| 8. Centrifugar a máxima velocidad a 4 oC durante 10 min.
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| [En este paso los complejos DNA cromosomal-proteínas precipitan, mientras que el DNA
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| plasmídico permanece disuelto].
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| 9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
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| [Debido a que la concentración de DNA no es suficiente para saturar la solución, este permanece
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| disuelto en el sobrenadante].
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| 10. Adicionar al sobrenadante 1 ml de etanol al 100 %. Mezclar con ayuda del vortex.
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| [El DNA es insoluble en etanol, asi que en este paso se busca precipitarlo].
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| 11. Refrigerar a - 20 oC durante 10 min.
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| [Ayuda a precipitar el DNA].
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| 12. Centrifugar a maxima velocidad a 4 oC durante 10 min.
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| [Permite concentrar el DNA en una pastilla insoluble].
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| 13. Retirar todo el sobrenadante con jeringa.
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| 14. Adicionar 120 μl de agua y resuspender con ayuda del vortex.
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| 15. Adicionar 15 μl de MgCl2 1 M. Mezclar con ayuda del vortex.
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| [Debido a que la preparación de DNA plasmídico esta contaminada con RNA, en este paso se
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| busca eliminar al RNA formando un complejo insoluble con MgCl2].
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| 16. Incubar en hielo durante 10 min y centrifugar a máxima velocidad.
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| 17. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
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| 18. Adicionar 300 μl de etanol al 100 % y 15 μl de acetato de sodio 3 M. Mezclar con vortex.
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| [Como se menciono con anterioridad, el DNA es insoluble en alcohol y la presencia del acetato
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| facilita la formación de un precipitado].
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| 19. Refrigerar a - 20 oC durante 10 min.
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| 20. Centrifugar a maxima velocidad a 4 oC durante 10 min.
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| 21. Retirar el sobrenadante y adicionar 1 ml de etanol al 70 %.
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| [En este paso el acetato y otras sales presentes en la preparación son disueltas en el agua].
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| 22. Resuspender con ayuda del vortex y centrifugar a temperatura ambiente a máxima velocidad
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| durante 2 min.
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| 23. Retirar el sobrenadante y secar con ayuda del DNA speed vac.
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| 24. Resuspender en TE-RNAsa (50 μg/ml) y analizar la preparación de DNA en un gel de
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| agarosa al 1 %.
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| ===Restricción===
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| Una reacción típica para digerir entre 0.1 a 1 μg de ADN en un volumen final de 20 μl
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| podría ser la siguiente:
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| - Llevar el DNA a digerir a 17 μl con agua ultrapurificada.
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| - Adicionar 2 μl del buffer apropiado (la concentración de los ¨buffers¨ es 10 X)
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| - Agregar 1μl de la enzima seleccionada. Generalmente la concentración de las enzimas
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| esta dada en unidades. Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1
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| μg de DNA en una hora.
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| - Incubar la reacción a la temperatura adecuada por una o dos horas.
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| - Dependiendo la enzima utilizada, la digestión puede detenerse incubando la reacción a
| |
| una temperatura de 75 oC por 15 min. o adicionando 0.5 M de EDTA (pH8) a una concentración
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| final de 10 mM.
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| ===Electroforesis en gel===
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| METODO
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| 1. Pesar la agarosa necesaria para preparar 100 ml de solución al porcentaje deseado.
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| 2. Adicionar la agarosa a 100 ml del buffer de corrida.
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| 3. Calentar la solución en el horno de microondas hasta que se funda la agarosa.
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| 4. Vaciar la solución en el molde con el peine.
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| 5. Dejar enfriar hasta que solidifique el gel.
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| ===Reacción de ligasa===
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| METODO
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| A un tubo eppendorf se la adiciona:
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| DNA inserto 5 μl
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| DNA vector 1 μl
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| Buffer 10X 1 μl
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| Agua HPLC 2 μl
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| T4 ligasa 1 μl
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| Se incuba la reacción por 12 hrs a 14oC
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| Nota: La reacción de ligación de extremos cohesivos se lleva a cabo a una temperatura de 12o a
| |
| 16oC para mantener un balance entre el alineamiento de los extremos cohesivos del DNA y la
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| actividad de la enzima.
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| ===Conjugación bacteriana===
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| METODO
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| ∞Inocular por separado 5 ml de medio LB con las cepas donadora y receptora (para la donadora
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| se adicionarán 150 mg de cloramfenicol).
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| ∞Incubar los tubos a 37°C en agitación por 8-12 h.
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| ∞Centrifugar las células bacterianas y lavarlas con la solución estéril de sulfato de Magnesio
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| (10mM).
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| ∞Resuspender con suavidad las células en 40 μl de la misma solución anterior.
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| ∞Colocar por separado 10 μl de cada cepa en una caja Petri con medio LB y 10 μl de cada cepa
| |
| en un mismo sitio de la misma caja.
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| ∞Dejar secar.
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| ∞Incubar por 12 h a 37 °C.
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| ∞Colectar la población bacteriana, cruza y parentales con palillos de madera estériles y
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| resuspender en 1 ml de solución estéril de Sulfato de Magnesio-Tween 40 (10mM-
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| 0.01%).
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| ∞Diluir la suspensión de la 10-1 a 10-5. Para ello, se tiene una serie de tubos con 900 μl de
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| Sulfato de Magnesio-Tween. Del tubo donde de resuspendió la cruza se toman 100 μl y se
| |
| añaden al primer tubo de la serie, se agita con vortex, se toman 100μl de este tubo y se añaden al
| |
| segundo y así hasta completar las diluciones. este proceso se hace tambien con las células
| |
| parentales, que serviran de control.
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| ∞De cada dilución platear con triángulo de vidrio 50 μl por caja de LB con los antibióticos ácido
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| nalidíxico (12 μg ml-1) y cloranfenicol (30 μg ml-1).
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| ∞Incubar a 37°C por toda la noche.
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| ===Transformación bacteriana===
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| METODO
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| Obtención de células competentes (para transformación con CaCl2).
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| 1) Preparar tubos con 5 ml de medio LB e inocular cada uno con la cepa de interés. Agitar con el
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| vortex e incubar durante toda la noche a 37o C.
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| [NOTA: Todo el manejo de cultivos debe hacerse en medio estéril].
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| 2) Diluir los cultivos 100 veces en 50 ó 100 ml de LB y dejar crecer hasta una D.O. (λ=550
| |
| nm)=0.45-0.55.
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| [Experimentos varios sugieren que en E. coli la transformación es óptima cuando las células
| |
| están en una fase tardía del crecimiento logarítmico].
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| 3) Centrifugar durante10 min a 6000 rpm, a 4o C.
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| 4) Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet (agitando con el vortex) en 20 ml de CaCl2 100
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| mM frío.
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| 5) Mantener las muestras en hielo de 20 a 90 min (los resultados son mejores si se dejan durante
| |
| 90 min) .
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| 6) Centrifugar durante10 min a 6000 rpm, a 4o C.
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| 7)Disolver el pellet en 2 ml de CaCl2 100 mM frío.
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| [Se cree que los iones divalentes tienen al menos dos funciones en la transformación: i.)la
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| formación de complejos de coordinación con los grupos fosfato del DNA y, ii )junto con las
| |
| bajas temperaturas, favorecen un estado de transición de la membrana en que ésta se encuentra
| |
| estática y semicristalizada, lo que permite que haya una mayor apertura o accesibilidad de los
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| canales membranales].
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| 8) Poner en tubos eppendorf alícuotas de 200 μl y añadir a cada una 100 μl de glicerol 40%.
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| 9) Mezclar con vortex.
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| 10) Guardar las muestras a -70o C.
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| Para checar que las células son competentes, transformar 200 μl de células con 50 ng de DNA
| |
| circular y platear en medio adecuado.
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| Transformación.
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| 1) Descongelar las células competentes en hielo.
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| 2) Añadir a cada tubo, con 100 μl de células, 2 ó 3 μl de la ligación con que se desea
| |
| transformar a las células. Dejar un tubo con sólo 50 μl de células sin DNA exógeno y darle el
| |
| mismo tratamiento que al resto de las células (control).
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| 3) Dejar reposar en hielo durante 20 min.
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| [Durante este tiempo, el DNA y las células competentes interactúan para lograr el
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| establecimiento en el interior de la célula].
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| 4) Dar un choque térmico durante 1 min a 42o C.
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| [Aunque este paso no es indispensable, se ha observado que aumenta la eficiencia en la
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| transformación ya que permite que la membrana celular vuelva a tener movimiento y se cierren
| |
| los canales de calcio (que se supone estaban expuestos)].
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| 5) Pasar los tubos a hielo y mantenerlos ahí durante 5 min.
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| 6) Añadir a cada tubo 1 ml de medio líquido LB.
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| 7) Mantener los tubos durante 1 hr a 37o C (sin agitación).
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| [Durante este periodo de recuperación, las células retoman su actividad metabólica y nuevamente
| |
| comienzan a sintetizar proteínas, incluyendo aquellas codificadas en el material genético recién
| |
| adquirido].
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| 8) Platear en cajas con el medio selectivo adecuado, 200 μl por caja. Platear también los 50 μl de
| |
| células competentes que quedaron sin transformar, en el medio selectivo deseado y en LB, como
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| control.
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| |
| Lectura recomendada:
| |
| *Hanahan, Douglas. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol.
| |
| Biol. 166: 557-580.
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| ===PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacción en Cadena de la Polimerasa)===
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| METODO
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| Lisis de colonias bacterianas.
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| 1. Tomar con un palillo de madera una colonia bacteriana grande y resuspender en 200 μl de
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| Tris-EDTA 10/1-NaCl 10 mM.
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| 2. Calentar durante 10 min a 95 oC.
| |
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| 3. Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 min.
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| |
| 4. Tomar 10 μl como templado de DNA para el PCR.
| |
| PCR.
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| 1) Hacer la siguiente mezcla: Orden de adición Volumen
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| Agua desionizada 1 61.5 μl
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| Buffer PCR 10X 2 10 μl
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| dNTP’s (dATP, dTTP, 3 2μl c/u dGTP y dCTP)
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| Enzima AmpliTAQ 4 0.5 μl
| |
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| |
| 2) Adicionar a la mezcla anterior lo siguiente:
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| Prímero 5’ 5 5 μl
| |
| Prímero 3’ 5 5 μl
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| DNA 6 10 μl
| |
| 100 μl/rxn
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| 3) Evitando dejar gotas o restos de la mezcla sobre las paredes del tubo de PCR, poner 2 gotas de
| |
| aceite mineral.
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| 4) Utilizando un termociclador llevar a cabo la reacción de PCR:
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| Se harán 30 ciclos de amplificación, cada ciclo comprende las siguientes condiciones de
| |
| temperatura:
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| - 94oC durante 1 minuto (desnaturalización del DNA templado)
| |
| - 56oC durante 1 minuto (alineamiento de los prímeros)
| |
| - 72oC durante 1 minuto (elongación de la cadena de DNA)
| |
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| |
| Habiendo concluido los ciclos, la reacción se mantiene a 4oC
| |
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| |
| 5) El producto amplificado se corrobora a través de una electroforésis en gel de agarosa y tinción
| |
| por Bromuro de etidio.
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| ===Reparación de extremos de ADN (blunting)===
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| METODO
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| 1. Mezclar los siguientes componentes en un tubo eppendorf:
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| H20 cbp 25 μl
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| Buffer Blunting 10X 2.5 μl
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| dNTP mix (1 mM) 2.5 μl
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| DNA XX μl
| |
| Blunt Enzime Mix 1 μl
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| 25 μl
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| |
| 2. DNA cortado con enzimas de restricción, se incuban a temperatura ambiente durante 15 min.
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|
| |
| DNA cortado mediante nebulización u obtenido mediante PCR, se incuban a temperatura
| |
| ambiente durante 30 min.
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| 3. Inactivar a 70 oC durante 10 min.
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| ===Apéndices===
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| ====1. Preparación de medios de cultivo y antibióticos.====
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| *'''Medio PY.'''
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| Peptona de caseina 5 g/l
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| |
| Extracto de levadura 3 g/l
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| |
| Agar 15 g/l
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| |
| Autoclavear a 120o C durante 20 min.
| |
|
| |
| Agregar 1 ml de una solución de CaCl2 0,7 M por cada 100 ml de medio.
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| |
| Solución de CaCl2 0,7 M
| |
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| |
| 7.769 g de CaCl2 en 100 ml H2O
| |
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| |
| Autoclavear a 120o C durante 20 min.
| |
|
| |
| *'''Medio LB.'''
| |
|
| |
| Extracto de levadura 5 g/l
| |
|
| |
| Peptona de caseina 10 g/l
| |
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| |
| NaCl 10 g/l
| |
|
| |
| Autoclavear a 120o C durante 20 min.
| |
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| |
| En caso de utilizar medios sólidos, se adicionan 15 g/l de agar bacteriológico
| |
|
| |
| antes de esterilizar en la autoclave.
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| |
| *'''Preparación y esterilización de antibióticos.'''
| |
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| Antibiótico Solución stock
| |
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| Acido Nalidixico (Nal) 20 mg/ml de NaOH 0.1 M
| |
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| |
| Espectinomicina (Sp) 100 mg/ml de agua
| |
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| |
| Carbenicilina (Cb) 100 mg/ml de agua
| |
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| |
| Tetraciclina (Tc) 10 mg/ml de etanol al 70 %
| |
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| |
| Los antibióticos se esterilizan por filtración con membrana de 0.22 μ.
| |
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| |
| ====2. Preparación de buffers y reactivos varios.====
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|
| |
| *'''0.5 M EDTA pH8.'''
| |
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| |
| EDTA (disódico) 47.1 g
| |
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| |
| H2O Aforar a 250 ml
| |
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| |
| Ajustar el pH con NaOH, filtrar y esterilizar.
| |
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| |
| *'''TE 50/20 pH8.'''
| |
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| |
| ''Solución stock Tris 1M pH8''
| |
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| |
| Tris 30.28 g
| |
|
| |
| H2O Aforar a 250 ml
| |
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| |
| Ajustar el pH con HCl, filtrar y esterilizar.
| |
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| Solución stock EDTA 0.25 M pH8
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| EDTA (disódico) 23,55 g
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| H2O Aforar a 250 ml
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| Ajustar el pH con NaOH, filtrar y esterilizar.
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| ''TE 50/20 pH8''
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| Tris 1 M 25 ml
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| EDTA 0.25 M 40 ml
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| H2O HPLC Aforar a 500 ml
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| *'''TE 10/1 pH8.'''
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| Tris 1 M 5 ml
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| EDTA 0.25 M 2 ml
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| H2O HPLC Aforar a 500 ml
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| *'''Tris-Boratos 5X.'''
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| Tris 53.89 g
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| Acido bórico 27.51g
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| EDTA (disódico) 3.72 g
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| H2O Aforar a 1 l
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| *'''Buffer de cargado 6X.'''
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| 0.25% de azul de bromofenol (bromophenol blue)
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| 0.25% de xilen cianol (xylen cyanol FF)
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| 15% Ficoll (tipo 400) en agua
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| Almacenar a temperatura ambiente.
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| ====3. Preparación de reactívos para extracción de DNA genómico.====
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| *'''Proteinasa K.'''
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| Disolver 5 mg de Pronasa en 1 ml de TE 50:20 y calentar 1 hr a 37 oC
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| *'''RNAsa.'''
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| Disolver 30 mg de RNAsa en 1 ml de agua HPLC y calentar 10 min a 95 oC.
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| *'''Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.'''
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| Mezclar 24 ml de Fenol, 24 ml de Cloroformo y 1 ml de alcohol isoamílico. Almacenar en frasco
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| ambar a 4 oC.
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| ====4. Preparación de reactivos para extracción de DNA plasmídico.====
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| *'''SOLUCIONES.'''
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| {|border=1
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| |--
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| |Solucion I.
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| |Solucion II.
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| |Solucion III.
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| |--
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| |1.7 ml de agua
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| |2.6 ml de agua
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| |29.4 g de CH3COOK
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| |--
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| |200 μl de glucosa500 mM
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| |120 μl de NaOH 5 M
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| |Aforar a 88.5 ml con agua
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| |--
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| |40 μl de EDTA 0.5 M
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| |300 μl de SDS 10 %
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| |Filtrar con membrana 0.2 μm
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| |--
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| |50 μl de TRIS 1M, pH=8.0
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| |Autoclavear y dejar enfriar
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| |--
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| |8 mg de Lisozima
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| |Adicionar 11.5 ml de CH3COOH
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| |}
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| *'''TE-RNAsa.'''
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| 5 μl de RNAsa a 10 mg/ml
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| 1 ml de TE 10:1, pH=8.0
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| ====5. Preparación de reactivos para Conjugación.====
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| *'''Buffer MgSO4 10 mM.'''
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| MgSO4,7H2O 0,246 g
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| H2O Aforar a 100 ml
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| *'''Buffer MgSO4 10 mM, Tween-40 0,01%.'''
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| MgSO4,7H2O 0,246 g
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| Tween-40 10 μl
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| H2O Aforar a 100 ml
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| ====6. Preparación de reactivos para Transformación.====
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| *'''CaCl2 100 mM.'''
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| CaCl2 1.11 g
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| H2O Aforar a 100 ml
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| ====7.Preparación de reactívos para Eckhardt horizontal.====
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| *'''N-Laurylsarcosina.'''
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| 0.3 g de Sarcosil en 100 ml de agua. Guardar a 4oC.
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| *'''Ficoll en TE 10/1.'''
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| 2 g de ficoll (40,000 MW) en 10 ml de TE 10/1. Conservar a - 20oC en alícuotas de 1 ml
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| *'''Solución de lisis.'''
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| 0.4 mg/ml de RNAsa A en agua, hervida 10 minutos. Añadir 1 mg de Bromofenol por ml.
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| Guardar a -20oC en alícuotas de 230 μl.
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| *'''SDS en agua.'''
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| 1 g de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) en 10 ml de agua. Añadir una pequeña cantidad de
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| xilencianol (solo para darle coloración). Guardar a Temp. ambiente.
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| *'''Lisozima.'''
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| 1 mg de lisozima por 100 μl agua. Preparar al momento de uso.
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