User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/16
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TP3-Sequenciação de DNA
Pelo método de Sanger usamos nucleótidos, dideoxinucleótidos marcados radioactiva ou fluorescentemente, uma cadeia molde, um primer e uma DNA polimerase.
É sequenciada a cadeia complementar por adição de nucleótidos ao primer, logo a cadeia sintetizada será igual á cadeia que é complementar daquela á qual o primer se liga.
Neste método são utilizados didNTP's, nucleótidos que não têm um grupo hidroxilo na posição 3', logo não há a formação da ligação fosofodiéster impedindo a progressão da elongação e fazendo com que a polimerase se desligue da cadeia molde.
Nao termina no primeiro nucleótido pois podee ter o grupo 3'-OH.
No inicio do electroferograma os picos não estão bem definidos, isto porque na a electroforese anterior a leitura a migração das sequencias mais pequenas é muito semelhante sendo complicado diferenciá-las. No final do electroferogram também existem cada vez picos mais pequenos e menos definidos isto porque a quantidade de moléculas de maiores dimensões com didNTP no final é menor e torna também a diferneciaçaõ entre os fragmentos.
Fragmentar o segmento em pedaços mais pequenos e de tamanhos diferentes e fazer a sequenciação de cada um deles em separado, tentando assim evitar os efeitos do tamanho na electroforese.
Indivíduo 1 TCGTGTTCTATGATcATGAGAGTCGCCG Indivíduo 2 TCGTGTTCTATGATgATGAGAGTCGCCG TCGTGTTCTATGATcATGAGAGTCGCCG O indivíduo 1 é homozigótico e o 2 heterozigótico, isto pode ver se pelo sobreposição de cores no segundo electroferograma e na diminuição da intensidade do do pico.
O mRNA deveria ser convertido em cDNA primeiro, depois ter um primer para se ligar à sequência complementar aquela que queremos sequenciar.
Considerando as mutações T->A no nucleótido 462 (mãe) e T->G no nucleótido 732 (pai): - MÃE - O pico correspondente ao nucleótido 462 teria uma sobreposição de vermelho e verde; o pico correspondente ao nucleótido 732 seria vermelho. -PAI - O pico correspondente ao nucleótido 732 teria uma sobreposição de vermelho e preto; o pico correspondente ao nucleótido 462 seria vermelho. -Maria- O pico correspondente ao nucleótido 462 teria uma sobreposição de vermelho e verde; o pico correspondente ao nucleótido 732 teria uma sobreposição vermelho e preto.
Para pensar
As primeiras sequenciações foram realizadas recorrendo a reacções de síntese do DNA. Em quatro tubos eram colocados pedaços de DNA e nucleótidos, em cada um dos quatro tubos era colocado um nucleótido radioactivo e três normais (ex:num tubo era colocado guanina radioactiva e adenina, citosina e timina normais) e depois corria-se uma electroforese em que em cada poço se colocava o conteúdo de um tubo, os fragmentos que incorporassem nucleótidos radioactivos a sua síntese acabaria aí e assim na electroforese era possível separá-los com base nos seus tamanhos e depois era só juntar a sequência final.
A estratégia terá sido quebrar os cromossomas em fragmentos de menores dimensões, sequenciar cada um deles individualmente e depois juntar todas as pequenas sequenciações até se ter a sequência completa. |