Biomod/2014/Sendai/temp/0821/Experiment

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Experiment

リポソームに味成分を閉じ込める実験

Purpose

DNAによりリポソームが放出されるまでにリポソームの中に味成分を閉じ込めておく必要がある。そのためリポソーム内にグルコースが閉じ込められることを確認する。本実験では閉じ込める味成分 の一例としてグルコースを上げ、リポソームの中に甘味の味成分であるグルコースを閉じ込める実験を行う。

Principle

人工細胞膜は疎水性であるため、イオン、アミノ酸やグルコースは透過できないようになっている。(ref. エッセンシャル)グルコースの濃度は糖度計を利用して測定する。 本実験ではグルコース溶液のみのサンプルAとグルコースを閉じ込めたリポソームを含むサンプルBを準備し、対照実験を行う。両者のサンプル内のグルコース総量は同じである。(溶液の全量も同じ) リポソームにグルコースが閉じ込められていればグルコースは糖度計の電極には作用しない。そのため前者は時間に関係なくグルコースの濃度が一定となり、後者は温度を上げる前はグルコース濃度は 低いが、温度を上げればリポソームが割れるのでグルコースの濃度が大きくなり、最終的にサンプルAと同じ濃度になるはずである。

Method

?Mのグルコース溶液(サンプルA)を作製する。リポソームを界面通過法により作成し、サンプルBを作製した。サンプルAとBを糖度計の電極の上に?µlを滴下し、グルコース濃度を測定した。その後、お湯にサンプルAとサンプルBを一緒に浸からせ温度を高くした状態の両サンプルのグルコース濃度を測定した。

(期待される)Result

サンプルAは温度を上げる前も後も濃度は変化せずに一定になった。サンプルBは温度を上げる前はグルコース濃度が低く、温度を上げた後はグルコース濃度がサンプルAと同じになった。

Discussion

Protocol

Making liposome
DOPC(10nM)27µl
Cholesterol(10nM) 3µl
Table1 Materials for liposome preparation

リポソームにコカコーラを閉じ込める実験

Purpose

上記の実験の妥当性をさらに検討するために、コカコーラをリポソームに閉じ込める実験を行った。

Principle

リポソームの中にコカコーラが閉じ込められれば、光学顕微鏡で観察した際にリポソームの中がコーラの色になるはずである。(←色素が閉じ込められているだけでは?)

Method

界面通過法によりリポソームを作製する際にインナーバッファーをコカコーラを使用してリポソームを作製し、光学顕微鏡で観察した。

(期待される)Result

リポソームの中にコーラの色を確認できた。

Discussion

Protocol

制限酵素の機能確認とバッファーの適性を評価する実験

Purpose

DNA回路の実現には制限酵素が正しく機能する必要がある。本実験では制限酵素の機能確認実験を行う。また、酵素の機能はバッファーの条件に依存する。ポリメラーゼとニッカーゼを使ったオシレーターの論文ではNBEバッファーを使用している。(ref.)我々のDNA回路はこの論文に従い、NBEバッファーを使用する。そのため、NBEバッファー中で正しく機能する制限酵素を選ぶ必要がある。本実験では制限酵素の候補として????を上げ、NBEバッファー中での機能確認を行った。

Principle

本実験では以下の配列のDNAを使用した。認識配列の制限酵素の認識配列以外の配列は同じであり、左側の配列は20bp、右側の配列は10bpである。制限酵素が作用すれば左側の20bp程度の配列と右側の10bp程度の長さのDNAに切れる。DNAのみのサンプルとDNAと制限酵素を加えたサンプルを各制限酵素について準備し、アクリルアミドゲル電気泳動を行う。また、「切れる前のDNAのバンド」と「切れてできたDNAのバンド」の蛍光強度を比較することにより、酵素の活性度合を評価する。

Method

NEBバッファー中のDNAを用意し、DNAのみのサンプルとDNAと制限酵素を加えたサンプルを準備し?%アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。各バンドの蛍光強度を測定した。

(期待される)Result

制限酵素を入れた方は切れる前のDNAと切れた後の2つのDNAのバンドが確認できた。 蛍光強度から?が最も制限酵素の活性の度合いが高かった。

Discussion

Protocol

CCGGTGGACTTAATGCGACATCTAGAAATGGTTAGC GCTAACCATTTCTAGATGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGGATCCAATGGTTAGC GCTAACCATTGGATCCTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAAAGCTTAATGGTTAGC GCTAACCATTAAGCTTTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGAATTCAATGGTTAGC GCTAACCATTGAATTCTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACACCATGGAATGGTTAGC GCTAACCATTCCATGGTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGCCGGCAATGGTTAGC GCTAACCATTGCCGGCTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGTAGACAATGGTTAGC GCTAACCATTGTCTACTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGTCTACAATGGTTAGC GCTAACCATTGTAGACTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAAGATCTAATGGTTAGC GCTAACCATTAGATCTTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACAGTTAACAATGGTTAGC GCTAACCATTGTTAACTGTCGCATTAAGTCCACCGG CCGGTGGACTTAATGCGACACCTGAGGAATGGTTAGC GCTAACCATTCCTCAGGTGTCGCATTAAGTCCACCGG Fitness value is -22.445723871822707

シーソーゲートの確認実験

Purpose

Principle

Method

Result

Discussion

Protocol

ドメイン 配列 xuavy CATGCCTTACTCTTGAGAGCGAATTGTGTCGTCTT AUXT GCTCTCAAGAGTAAGGCATGATAGG txu CCTATCATGCCTTACTCTTG vyaxu GAATTGTGTCGTCTTAGAGCCATGCCTTACTCTTG AYVA GCTCTAAGACGACACAATTCGCTCT vya GAATTGTGTCGTCTTAGAGC px TGGCACCTGTCTACCCATGCCTTACTCTT VAUX CGCTCTCAAGAGTAAGGCATG

サンプル

Purpose

Principle

Method

Result

Discussion

Protocol

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