Biomod/2014/UANL/Katia/ensayos preliminares/uricasa

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Uricasa

Metodo: Espectrofotometria A290. Oxidación de A. úrico a Alantoina.
Condiciones: pH 8.5, 25C.

Reactivos:
- Buffer Borato de sodio 0.1M pH8.5
- s´ln A. úrico 0.12 M
* s´ln A. úrico:
Disolver carbonato de litio en 15mL de agua y filtrar. Preparar solucion fresca disolviendo 100 mg de acido urico en filtrado. Calentar a 50º - 60º C puede ser necesario
*
Antes de usarse 0.1 M de borato de sodio y 0.12 mM de acido urico deben ser oxigenados burbujeando O2 por las soluciones 10-15 minutos. Reoxigenar cada 20 min.

Enzima
Disolver a un mg/ml en buffer de borato de sodio frio (5º C) 0.1 M pH 8.5
Inmediatamente duliur a concentracion 0.01-0.1 unidades/mL

 
Procedimiento
Ajustar el espectrofotometro a 290nm a 25º C


CUBETA:
Buffer Borato 0.5 mL
0.12 mM Acido Urico 2.0 mL

 Incubar en espectrofotometro por 4-5 minutos para alcanzar temperatura de equilibrio y establecer el rango de blanco. En tiempo cero agregar 0.5 mL de enzima y anotar la disminucion de A290 por 6-7 minutos.

REFERENCIA: http://www.worthington-biochem.com/up/assay.html

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