Etchevers:Notebook/STRA6 in eye development/2009/03/24

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Miniprep suite

Coller les gels dans le cahier de manipe d'Adeline.

J'ai repris les 30 μL restants des digestions EcoRI avec 40 du tampon EB (Tris) pour une extraction phénol-chloroforme, suivi par extraction chloroforme, pour les 6 clones apparemment avec insert, afin que Nicolas fasse une réaction de séquence dessus.

Ces six clones semblent, pour le PAX6 avec site Xho (+), les 3, 5, 7 et 8; pour le PAX6 amplifie avec des amorces sans site de clivage Xho (-) pour tagger par le poly-HIS, les clones 6 et 7 seulement.

J'ai ramene les 40-55 μL avec 27 μL ammonium acetate 7.5M jusqu'a 100 μL total avec de l'eau. Ensuite ajouter 250 μL EtOH absolu. 45 minutes -25 puis tourner 13K rpm au froid pendant 30 minutes. cf. this insert.

"13.3 μL of 7.5 M ammonium acetate and 1 μg of either lambda DNA Hind III digest or pBR322 DNA was brought a finalvolume of 50 μL with water. 125 μL (2.5 volumes) of absolute ethanol was added and the resulting solution was incubated 1 hour at –20 °C. After centrifugation at 15000 x g for 15 minutes, the supernatant was aspirated and the DNA pellet was air dried and resuspended in 50 μL water."

J'ai récupéré les cultures fraiches d'hier soir, qui ont bien pousse en 18h (5 mL). Après avoir fait du 50% glycerol/50% LB+ampi 50 μg/mL j'ai mis 600 μL dans des tubes de congélation, puis ajouté 1.2 mL de chaque culture et mélangé. Placees debout a -20°C jusqu'au transfert en -80°C.

Centrifugé les 3.5 mL restants pour culotter, 6 minutes au frais, 1600 rpm. Un peu de perte mais de beaux culots quand même pour minipreps. Congelés aussi -20°C dans tiroir avec enzymes.

  • Heather 08:18, 24 March 2009 (EDT):


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