IGEM:Tokyo/2008/ideas4

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調べることが班別にまとまってきたと思うので作ってみました。
書記長さんが毎回メモするのも大変だと思うので、何か調べたこと、考えたことがあったら随時書き込んで、まとまったものを班ごとにミーティングで発表&議論するというのはどうでしょうか?
所属の班が決まっていない方は興味のあるアイデアのところに名前を書き足してください。(最低2つ以上)

Contents

振動

担当:竹内、上村、島崎、小松

鞭毛→根元のモーター+毛。モーターは6000~17000rpm。100~300Hz。毛がつくと200~1000rpm。
鞭毛にこだわらず、キネシン、ダイニン、ミオシンや人の筋肉とか使って振動できないか。
弦は別もので、動かすのは細菌とかでも。
問題点
回転を一定にできない。
振動数かえるために弦の長さ変える機構?
細胞を無理矢理くっつけるor分裂時に分裂し損ねたやつ。
もし大腸菌をつかうなら、水中を伝える必要がある。→イルカやくじらの発声の仕組み調べる必要。


細胞の同期の必要性。’06imperial参照
大腸菌の鞭毛はATPにより回転方向を変える。
同期させるのに、バイオフィルムで大腸菌をパックし、フィルムの動きで振動を生み出す。
虫に、水中で音を鳴らす虫がいる(ミズムシ:前足をこすり合わせる。前足がある時点で、どういう虫かわかるよね?)
出力を音にするのではなくて、入力を音にしてもよいかも。
信憑性はないが、酒酵母に音を聞かせるとこがある。そういえば、植物に声をかけたほうがよく成長するとかいう論文が出・た記憶がある。(たしか結局根拠なくて却下されたはず・・・・。)
振動させるのは鞭毛か、心筋か?それとも。振動する信号を細胞に出させるのか?
水中では高音しか聞こえない。共振を利用できないか。
まず、何で周期的な変化を出すのか考える必要がある。

直接音を出すのではない場合には信号を出力させて、測定した情報を音として出力するということになると思いますが、
①信号の入力にあたるものを用意する(例えば物質Aを滴下すると「ド」にあたる信号を出力するようにする)
②大腸菌の遺伝子回路に始めから信号の情報(音階にあたる情報)を組み込んでおいてそれを出力させる。
のいずれかになると思いますが、②だと今までいろいろ案が出ていたメモリーとも組み合わさって面白そうな気がします。
出力信号は最も簡単には2進法で表わせばいいと思いますが、媒体を単純に化学物質とすると、「1」、「1」と続いた場合の判別はどうするのか?ということが問題になりそうです。化学物質の分解が早くないとできなさそう。
それから転写・翻訳、信号の伝播(物質の拡散)のスピードも気になります。
Wikipedia リボソームのページから引用
「真正細菌や古細菌の平均的な翻訳速度は毎秒20アミノ酸で、mRNAにおける60ヌクレオチドである。この値はRNAポリメラーゼによる合成速度である毎秒50~100ヌクレオチドに近い。」
福岡大理学部化学科のページによると大腸菌のRNAの合成速度は40base/secみたいです。
転写・翻訳の速度をどちらも50base/secとしてタンパク質が100個のアミノ酸だとしても300/50*2=120sec=2minで分のオーダーだからタンパク質は使い物にならないかも。
シグナル伝達を調べてみると、cAMPcGMP、カルシウムイオン、イノシトール三リン酸、ジアシルグリセロールなどの物質がセカンドメッセンジャーとなり、細胞間の情報伝達を果たしているようで、1msecほどでこのような反応が起きるそうです。
(島崎)

動脈硬化

担当:山本、山崎、鈴木、河合、田中、馬谷、三津澤

コレステロールがたまることで動脈硬化が起きる。
コレステロールはタンパク質に囲まれて血液中を移動
そのタンパク質には二種類あり、
LDL:悪玉。肝臓で作られたコレステロールを細胞へ。血管に傷があると貯まる。
HDL:善玉。血液中の余ったコレステロールを肝臓へ。
血管内壁に傷があると、LDLコレステロールが蓄積し、LDL酸化がおこる。白血球はそのLDLコレステロールを食べて死ぬ。けれども、コレステロールは残り、血管が細くなる。
コレステロールを分解する酵素コレステロールオキシダーゼ(COX)
商品化されているもの(血清中のコレステロール濃度調べたり、膜構造を調べるのに使う)と、細菌が作り出すものとある。
前者は分解産物がCEOだが、後者はHCEOである。
Chromobacterium SP.DS-1という細菌が作る。
アミノ酸配列を調べてpET21-d(+)プラスミドに入れる。大腸菌に入れたらうまくいった。
このCOXは有機溶媒で失活しないし(商品化されているものはする)、熱に強い。構造的にも安定で、金属あっても錯体あっても効果ある。
HCEOは水溶性なのか?また、有害なのか?調べる必要がある。
COXの分解産物HCEOは不要性で体に悪いらしい。
人ではCYPっていう分解酵素が働いています。これは薬剤の分解とかにも働いていていろんな種類があります。たしか詩とクロム450の略で、CYP1、2、3とかいろいろあります。
コレステロールがたまる予防法はないかな。血管につかないようにするとか。
血管内に細菌を入れるようにするのか、透析という形にするのか。
透析だと、フィルターの問題になるのではないか。HDL(6~12nm)LDL(20~30nm)
in vitroではHDLの合成可能。⇒in vivoでは?HDL,LDLの作り分けできるか。
発表しておいて、申し訳ないのですが、情報元を紛失してしまって、合成方法が見つかりません。
An endothelial receptor for oxidized low-density lipoproteinというnatureの論文にはLDLは
ヒト細胞のものを遠心分離で取り出したみたいです。
クオラムセンシングでLDLをすくなくして、HDLを増やすことができないか。

3/25のときのまとめをpdfで作成しました。画像をたくさんとりいれているため、こっちの形式にしました。
Media:cholesterol1.ogg

本当に大腸菌を血管に入れて大丈夫なのかっていう疑問をみんなかんがえてるとおもうんですけど、しらべてみたら、とりあえず多くの大腸菌を体の中に入れるとまず、大腸菌の表面にあるLPS〔糖脂質〕のLipd A という活性本体が宿主のマクロファージを活性化させて、炎症性サイトカインのを産出するようになってしまい、次に、大腸菌は、内毒素をもっているため、マクロファージに分解されると毒素がでてしまい、結果、敗血症という重大な病気になってしまうようです。 今後の実際に、血管に入れるための可能性をちょっとあげてみたいとおもいます。 ①グラム陽性菌には、LPSがないため、炎症サイトカインはおそらく産出されないのでは? ②結核菌、らい菌が、上皮系細胞に進入、マクロファージ中で生存するために必要なたんぱく質を発現する遺伝子配列はわかっているようなので、〔mycobacterium cell entry protein : mceタンパク〕なんとか、これを利用できないかな?

この血管に生物を入れようというプロジェクトをやるならばやっぱり、なんとか実際に血管にいれてもいいようなアイデアをかんがえたいです。 なんかおもいついたら、書き加えてください。これは無理じゃないかっていう意見もかいてください。正直行き詰ってます。 血管にいれれたらいいなとはおもってるんですが、相当難しいとおもうので、もうひとつ似たようなジャンルで、「腸とか消化器系で、体にいいことをする」っていうのを、かんがえてみたいので、〔付加価値食品にちかくなるかもしれませんが〕なんかいい案があれば、かいてほしいです。てなわけで勝手に、欄作ってみます。山本

腸にいいこと




たばこの副流煙

担当:山本、山崎、田中

煙草の副流煙をどうにかできないか。
ニコチン分解酵素(CYP2S6)、タバコスズメガにある。
実用性やコストの問題がありそう。
ニコチンを水に溶かす必要がある。
喫煙前に口の中にスプレーして禁煙療法にしては?
どうやって副流煙をとりこむか。フィルターだけだと細菌は必要ないよね。

/タバコの成分

スカンク大腸菌
無害で不快な物質を使る大腸菌(あるいは酵母、納豆菌)を、タバコ、アルコールをやめてほしい人に飲ませる。
約束を破って飲酒、喫煙する人を、トラウマになるくらい嫌な気分にさせる。
無害で不快な物質は、ニオイ物質が最適。/test
ニオイ物質 悪臭-wikipedia

物質名
にほひ
感じる濃度
ノルマル吉草酸
むれた足
0.002ppm
イソ吉草酸
むれた足,チーズ
0.004ppm
メタンチオール
腐ったキャベツ 0.004ppm

·くさくない納豆は開発されている。ということは、同じ遺伝子領域の発現を調整してやればいいんでは?
→ロイシンを出発点としたイソ吉草酸合成酵素(yqiT)のゲノム情報あり納豆菌の遺伝育種
ニコチンやエタノール等の、禁止行為に特有の物質を大腸菌の膜が選択的に透過させることができるか?
→人間のニコチン性アセチルコリン受容体の構造、ゲノムはわかっている。ただ、それを菌が発現できるか、さらに 菌においても膜タンパクとして正常に作用できるかが問題。
受容体のゲノム特許1受容体のゲノム特許2


体内時計

担当:小松、島崎、竹内、三津澤、富沢

大腸菌で目覚まし時計を作ろう。
時計の部分とアラームの部分。
時計はMcGillのやつが8時間だったのでそれを3回で24時間にするとか。
大腸菌以外の体内時計を埋め込む?
体内に入れると光はいらないので暗いところで働くものを。
深海魚はまだ研究が進んでいない。
シアノバクテリアの時計遺伝子。KaiC:24時間周期でリン酸化、脱リン酸化を繰り返す。→名古屋大理学部近藤研
ただ、この反応の触媒であるKaiA,Bは光により調整されるので、光がないとずれるおそれ。
アラームは音、ヒトの脳を活性化する物質、体温上昇するもの、血液の流れを促進するものとか人に不快じゃないものかな。
シアノバクテリアを時計として使って、大腸菌をアラームに使えないか?(communicationはクオラムセンシング)
シアノバクテリアは遺伝子導入しにくい。時間と同じ周期で分泌する物質が見つかってないので難しい。
大腸菌同士のほうがやりやすいと思われる。
大腸菌内に時計をもたせるのは過去の研究であった。
Kaiはシアノバクテリア以外にもあるらしい。
Kaiの周期的な反応には①リン酸化する、しないと②KaiC自身の量がかかわっている。
②は転写翻訳の周期であり、それが丁度時計と同じ。
低温化では①②両方の条件が必須。
また、周期を長くするPEXや短くするCikAの存在も知られている。
KaiA過剰発現させても、サーカディアンリズムは保障される。
p53変異(がんになりやすい)マウスにCry変異(サーカディアンにかかわる遺伝子に変異)をいれた⇒発がん率下がった。寿命2倍に。おそらく、p53変異した細胞がアポトーシスしやすいからだろう。
動脈硬化などの治療薬フィブラート:体内時計の調節していた。→産業技術総合研究所
・オシレーションの回路を使うか?
・Kaiをつかうか?

4/15のチャットでのミーティングにて
・初回の実験はKai遺伝子の後ろにGFPを導入してみることにしようという方針になりました。最初ということもあり、確実にできそうな実験から。
・次回18日MTGまでの課題となるのは、Kai遺伝子付近のシアノバクテリアの配列の研究、導入方法の導入方法のプロセス化でしょうか。
参考:http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/
    http://cyano.genome.jp/
・あと、名古屋大学の1993年の論文も読む必要がありますね。
タイトル:Circadian rhythms in prokaryotes: Luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria
著者:Takao Kondo
リンク:http://clock.bio.nagoya-u.ac.jp/web/paper/1993/kondo.pdf
・直接な遺伝子組み換え制御がだめっだたら、シアノバクテリアの群れと大腸菌の群れを別々用意して、その間に何かのつながりを作ったらどうでしょう、という案も。シアノバクテリアから周期を持って発現される物質がなんなのか、それが細胞の外に出ることができるのか、メッセンジャーとして働くか、などを調べてみないといけません。(Tsinghua2007などが参考か?)

E.coliへの時計導入は2006年に千葉大のチームさんがやろうとしてたみたいです。 http://parts2.mit.edu/wiki/index.php/E_colock


【チャットMTG用掲示板】

  • 第一回研究室訪問

1.質問事項研究室
a)シアノバクテリアでホルモンは発現できるか?また細胞外へ放出できるか?
b)植物の匂いの遺伝子は導入できるか?←質問に行くまで植物の匂い発現遺伝子について調べる必要あり
 ・発現した物質はシアノバクテリアにどう影響を与えるか
c)psbAIの導入方法。実験方法。用語説明生物発光レポーター法
c')psbAIの役割は何か、どうしてここで出てきたのか?←質問に行くまでにまだ調べる余地あり
d)枯草菌に入れる場合どうするかのヒントなど←質問に行くまでにまだ調べる余地あり
e)違う細菌間のクオラムセンシング
f)シアノバクテリアに導入可能な追跡タンパク質はなにか
g)シアノバクテリアはアウトプットを出すか?出すとしたらどんなものをアウトプットとして出すのか

2.ホルモンで使えそうなもの
ACTH(副腎皮質刺激ホルモン)
コルチゾール
(ホルモン以外で)カフェイン

3.その他忘備録
《匂い》
過去の匂い系プロジェクト
Edinburgh 2007
バナナの匂いを作るMIT 2006
非メバロン酸経路wikipedia

4.報告(今後の課題)
a)匂いアウトプット→代謝経路を調べる(酵素と基質を調べる)KAGGデータベース



【7.16チャットMTG用掲示板】
①体内時計班の作りたいものの最終形態
1細胞レベルで、  「2つの振動する系を組み合わせて、出力として面白い振動パターンをつくる」


②実験の流れ
2-3時間のタイムスケールでの振動についてシミュレーション結果を見て、振動パターンをどれにするか決める。
そこから振動物質のあたりをつけて自分たちで作成する
・材料 ・論文

付加価値食品

担当:鈴木、河合、田中、上村、山崎、馬谷、富沢

付加価値食品
食べ物に含まれる菌に何かを作らせる。
体に役に立つタンパク質を発現させるとなると、吸収の際にタンパク質は分解されるので意味がない。
栄養価を高める    –栄養素の効果の評価は「健康食品」の安全性・有効性情報
発酵食品の利用    –腸内細菌が少しわかるおなかジャーナル

パン酵母
発酵段階で遺伝子を発現させる。(じゃないと、熱とか、乾燥とかのストレスかかっちゃう)
デンプン(小麦由来)からグルコースを作るようにさせて、甘いパンを作ろう。
グルコースからフルクトース作って(グルコースイソメラーゼ)甘くする。放線菌とかはこの酵素を持っている。
しかし、パンの製造段階で、砂糖水を加えている。すなわち、フルクトースをグルコースにかえる酵素がパン酵母にある可能性。
・パンの作り方を調べる必要あり。

Media:Gla_to_Yeast.pdf←Rhizopus(クモノスカビ)が持つグルコアミラーゼを酵母で発現させることに成功した論文です。
やっていることは、FIG. 4. を見れば大体わかると思います。
pRGA39は、RhizopusのゲノムDNAのグルコアミラーゼ遺伝子を含む部分をプラスミドにしたものです。イントロンがあるため、このまま酵母に入れても発現しません。
pCGA239は、グルコアミラーゼのmRNAから作ったcDNAです。なぜか5'側の塩基が欠けているので、このまま酵母に入れても発現しません。
論文の実験では、それぞれのプラスミドに、最初の矢印のように変異を入れて制限酵素サイトを作っています。次に切り貼りして、最後にもう一度変異を入れて元の遺伝子の配列に戻してあります。

この方法で一応グルコアミラーゼの遺伝子を持ったプラスミドを作ることはできるのですが、かなりめんどくさいので、切り貼りしなくてもうまくいった実験例を探してみたいと思います。
あと、実際に形質転換するときはこれを使えばいいのかな?


食品に入れてみたいもの
・ケセルチン:がん、アレルギーに効く。抗生物質でもある。DNA配列不明。
・硫化アリル:抗生物質。血液サラさらなど。
上記二つはたまねぎ、にんにくにある。
メチル化カテキン:緑茶にある。花粉症予防。ゲノム解読。特許出願
クルクミン:ウコンにある。抗ストレス物質、がんに効く。東大農学部堀之内研でやってる。
テアニン:お茶のうまみ。抗酸化剤。特許出願

貧困な国で不足している物質
I₂、F、Zn。さすがにこれは難しい・・・。
vitaminA(目の乾燥、脂溶性)、C(壊血病、コラーゲン生成されない、水溶性)、D(骨作るのに必要、脂溶性)
脂溶性のものは過剰摂取も危険。
vitaminCは過剰にとっても大丈夫。ではその生成過程とは?
D-glucose⇒D-glucose-6-phosphate⇒D-glucoes-1-phosphate⇒VDP-D-glucose⇒VDP-D-glucuronic acid⇒D-glucuronic acid⇒L-glonic acid⇒L-glono-γ―lactone⇒vitaminC(L-ascorbic acid)
長い・・・。
最後の反応にかかわる酵素(L-glono-lactone-oxydase)が人にはない。
どこからどこまで人や酵母にあるのかは不明。
お酒にvitaminCを作る酵素を発現する酵母をいれれば・・・(すっぱくなりそう)

バナナヨーグルト
匂いはある。〔'06 MIT〕
色を検討中。

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