IGEM:UNAM-Genomics Mexico/2009/Notebook/iGEM 2011 H2/2011/05/13

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Transformación de bacterias con las construcciones de Wi-Fi Coli

Objetivo: Transformar bacterias con las construcciones que se sintetizaron el año pasado para el proyecto “Wi-Fi Coli: A Communicolight System”. Éstas bacterias serán de ayuda para el equipo iGEM de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

Material: Medio de cultivo LB Kanamicina (líquido, 30 µg / mL) Ampicilina (líquido, 100 µg / mL) Células competentes Construcciones: csar_csas_noscar_rbs (kanamicina) 2_LRE (kanamicina) 2_LuxY (kanamicina) 2_Lumazine (kanamicina) 2_LovTap (kanamicina) promCcaR (ampicilina) Tubos Eppendorf estériles

Nota: Para futuras referencias la correspondencia de los números con la construcción es la misma que la que se indicó en la sección de “Material”, es decir, el número 1 se refiere a la construcción csar_csas_noscar_rbs (kanamicina).

Procedimiento:

-Preparación de los medios donde se sembrarán las bacterias transformadas. Preparar medio de cultivo LB con kanamicina a una concentración 1:1000. En este caso, se adicionaron 250 µL de kanamicina a 250 mL de medio LB. Preparar medio de cultivo LB con ampicilina a una concentración 1:1000. En este caso, se adicionaron 200 µL de ampicilina a 200 mL de medio LB.

-Añadir a cada tubo eppendorf 100 µL de células competentes previamente descongeladas en hielo. Dos de los ocho tubos empleados corresponden a controles, uno de kanamicina y otro de ampicilina.

-Añadir 2 ó 3 µL de la ligación que con la que se quiere transformar a las bacterias. En este caso, se agregaron 2 µL de cada construcción a los 100 µL de bacterias competentes.

-Dejar resposar los tubos eppendorf en hielo durante 20 minutos.

-Dar un choque térmico durante 1 minuto a 42º C. En este caso, se realizó el choque térmico por aproximadamente un minuto y medio.

-Pasar los tubos al hielo nuevamente y dejarlos reposar durante cinco minutos.

-Añadir a cada tubo 1 mL de medio líquido LB.

-Mantener los tubos durante una hora a 37º C sin agitarlos.

-Platear en cajas con el medio selectivo adecuado, 200 µL por caja. Platear también 50 µL de células competentes que quedaron sin transformar, tanto en medio selectivo como LB solo a manera de control. Se realizaron dos réplicas para cada una de las construcciones (tubos 1 - 6), sólo una réplica tanto para los controles en kanamicina, ampicilina como para LB solo.

Las cajas están numeradas de acuerdo a la construcción con la que se transformó a las bacterias.

-Dejar las cajas en la incubadora a 37º C.



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