User:Diogo Amaral/Notebook/Caderno BioMol/2010/03/16

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TP3 O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação? Cadeia de ADN molde, um sequência primer, a enzima ADN polimerase, nucleótidos livres e os quatro dNTPS. Que cadeia é sequenciada? É uma cadeia complementar do molde de ADN que é sintetizada de 5' para 3', a partir do primer. Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação? Porque usa bases "desoxi" quimicamente alteradas para terminar as sequencias sintetizadas numa base especifica. Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo? Porque só os nucleotdios desoxidados é que não tem um grupo OH no carbono 3' da sua pentose, o que causa o termiino da sequenciação. Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem? Hà um bolha de tinta entre a posição 420 e 430. Sequencia longa de Cs e Gs que podem formar estruturas plas quais o ADN polimerase não consegue passar e por isso ha uma paragem subita do sinal da sequencia de ADN O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo? Realizando várias reacções de sequenciaçao com primers diferentes. Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo? 1 - agcacaagatactagtactctcagcggc 2 - agcacaagatactactactctcagcggc Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder? Realizaria um cycling sequencing. O primer complementar pode ser obtido através da reacção de degradação de de Edman ou espectrometria de massa. Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1. 1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo? Mãe: na posição 462 esperaria encontrar um pico vermelho, onde deveria estar um verde Pai: na posição 732 esperaria encontrar um pico vermelho onde deveria estar um azul 2. Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique. Não, pois apenas uma das cadeias serve de molde para a sequenciação. Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.