User:Gabriela Santos/Notebook/GabrielaSantos BIOMOL/2010/03/23

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PCR e RT-PCR [edit] Introdução A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por issoo método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA.

A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR

Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR

Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.


[edit] Questões Que características deve ter um primer de PCR? Cada um dos primeres deve ser complementar a cada uma das nossas sequencias, a partir do local onde queremos comecar a replicaçao, no sentido 5' para 3'.

Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Primer especifico de gene: primer que contem uma sequencia de DNA especifica complementar à sequencia que queremos replicar. Corresponde ao local na sequencia de DNA onde queremos começar a replicação. Permite obter fragmentos de DNA especificos a partir do mRNA.

Primer oligo-dT : primer para sintese de cDNA. São primers que apenas se ligam à cauda de poly-A no mRNA, distinguindo-os dos restantes RNAs, local onde a transcriptase reversa se liga. Todos o cDNAs que utilizam estes primeres contem a terminaçao 3' do gene. Se o gene for longo demais a enzima pode por vezes nao conseguir chegar até à terminaçao 5' ficando o cDNA desprovido dela. Isto pode ser crucial se o nosso local de interesse for perto desta terminação. neste caso este primer pode nao ser o mais indicado. É um primer indicado quando se quer sintetizar cDNA provenientes de mRNAs differentes, cuja a unica semelhança é a existencia de caudas poly-A, no final de cada mRNA.

Primer random : primer de DNA de cadeia simples que contem 6 a 8 nucleotidos colocados aleatoriamente na sequencia e que nao correpondem a nenhum local especifico da sequencia que queremos replicar. É um primer que pode ser utilizado para compensar a falha do primer anterior, pois a criaçao de varios primers aleatorios permite-nos obter varias combinaçoes que podem correponder a parte que queremos sequenciar. Existem varios tipos de RNA, entre elas tRNA, mRNA, rRNA, etc, e sabendo que a quantidade de mRNA existente na celula é apenas de 10%, este primer pode não ser o mais indicado pois vai gerar demasiadas copias das quais a maioria não sao necessarias.



Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Extrair DNA genomico dos membros da familia a testar. Desenham se dois pares de primers localizados de forma a ser possivel amplificar as sequencias genomicas que devem conter as mutacoes tendo em conta os locais das mesmas conhecidos nos genes da mae e do pai da Maria. Apos amplificacao dos dois fragmentos delimitados pelos primers, estes sao separados por electroforese em gel de agarose, purificados da agarose e sequenciados para confirmar a presenca da mutacao. Em alternativa, apos a amplificacao de cada fragmento podera fazer se um corte por uma enzima de restricao caso o seu local de reconhecimento seja afectado pela mutacao impedindo o corte. Neste caso estamos perante um metodo de diagnostico por RFLP em que o tamanho dos fragmentos de restricao obtidos na presenca ou ausencia de mutacao serao diferentes.


Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Extrair o RNA total das celulas que expressam a betaglobina. Depois faz se um RT PCR para amplificar o RNA mensageiro da beta globina usando dois primers especificos localizados nas sequencias 5' e 3' UTR de forma a poder amplificar toda a regiao codante. Desta forma poder verificar se o gene da beta globina e expresso nessas celulas.


[edit] Nota: Se quiser incluir detalhes práticos sobre as reacções, consulte: Protocolo Taq polimerase Protocolo Transcriptase reversa



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