User:Gaston Paris:Notebook/Deleciones CheY-LOV

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Construcción vector para deleción 1671

Estoy retomando las anotacione sporque sino me pierdo. El objetivo es construir dos vectores pK18mobSacB con insertos de deleción de LOV y 1671 pra construir doble y triples mutantes sobre la cepa B. abortus 2308 ΔCheY Ya construí el vector pK18mobSacB con ΔLOV, me falta el mismo vector con Δ1671. Para eso tengo amplificado y digerido con EcoRI el inserto Δ1671 y me falta clonar en pK18mobSacB.

Digestión pK18mobSacB con EcoRI

pK18mobSacB 10μL NeBuffer Eco 2μL EcoRI 2μL H2O 6μL

Incubo a 37°C. Agrego CIP.

Corro un gel de agarosa. No se ve nada. FRACASO!! Repito mañana.

Repetición. Digestión pK18mobSacB con EcoRI

Repito el protocolo de ayer de digestión y tratamiento con fosfatasa. Corro en un gel y purifico la banda por geneclean con sílica casera. Siembro 2 μL de 20 μL totales en un gel de agarosa.

Marcador: 1 kb ladder (Promega)

Ligación

Tomo el fragmento purificado y digerido con EcoRI, precipitado y seco.

  • Agrego 6 μL de H2O y resuspendo.
  • Agrego 2 μL del vector pK18mobSacB/EcoRI/CIP.
  • Agrego 1 μL de buffer ligasa 10X.
  • Agrego 1 μL ligasa Promega.

Lo dejo overnight en un baño de agua en el cuarto frío. Temp inicial 20°C.


Transformación y colony PCR

Calle 1 de arriba y abajo: Marker Movil 19. Calles 2 a 11 abajo: 10 μl de las colony PCRs del 1 al 10. Calles 2 a 10, arriba: 10 μl de las colony PCRs del 11 al 20. Calles 12, arriba y abajo: 5 μl del fragmento 5' que utilicé en la PCR recombinante
Calle 1 de arriba y abajo: Marker Movil 19. Calles 2 a 11 abajo: 10 μl de las colony PCRs del 1 al 10. Calles 2 a 10, arriba: 10 μl de las colony PCRs del 11 al 20. Calles 12, arriba y abajo: 5 μl del fragmento 5' que utilicé en la PCR recombinante

Al día siguiente de la ligación la temperatura del baño estaba a 12°C. Transforme DH5α competentes químicas con 5 μL de la ligación en 100 μL de células y plaquee todo en LB-Km25.

Hoy preparé una mix de colony PCR

MIX X1 X22
1671_5_FWD_Eco 10μM 1 μl 22 μl
1671_5_REV 10μM 1 μl 22 μl
TaqBuffer 10X 2 μl 44 μl
dNTPs 2mM 2 μl 44 μl
MgCl2 50 mM 0.6 μl 13.2 μl
Taq IIB 1 μl 22 μl
H2O 12.4 μl 272.8 μl

Preparo la mix y alicuoto en 20 tubos de 0,2 ml. A cada tubo le pipeteo una colonia y largo en paralelo un tubo de vidrio con 6 ml de LB Km25.

La reacción de PCR la corro en el ciclador genius con los sig ciclos:

  • 95°C por 5 min
  • 35 ciclos de:
    • 95°C por 45 seg
    • 55°C por 30 seg
    • 72°C por 30 seg
  • 72°C por 5 min

Pongo a crecer los tubos del 1 al 8 a 37°C.


Notes

El vector pK18mobSacB está mal. Voy a retomar este proyecto pero con pK19mobSacB

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