User:Goncalo Correia/Notebook/BIOMOL/2010/03/23

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TP4

*Que características deve ter um primer de PCR?.

Um primer deve ser complementar à sequência de maneira a permitir a amplificação da zona desejada, hibridar com uma sequência única e bem conservada, ter um tamanho intermédio (muito pequeno e pode haver ligações a sítios que não os desejados, muito grande e não se desemparelha do DNA), e deve ter um ponto de temperatura adequado para permitir a hibridação e desemparelhamento no momento certo de cada ciclo.


*Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam?

Primer Específico de Gene: Oligonucleótido complementar a zonas da sequência, permite amplificar o RNA desejado, independentemente do tipo. É necessário conhecimento prévio da sequência a hibridar.

Primer poly-dt: Liga à cauda poly-A, apenas permite a amplificação de mRNA's, e pode haver amplificação incompleta se o mRNA for muito grande.

Primer Random: Cocktail de primers, normalmente com um tamanho 8-12 nucleótidos e com todas as combinações de bases possíveis neste tamanho. Origina fragmentos de DNA mais pequenos, e é a opção que maximiza a probabilidade de cobrir toda a sequência (zonas mais afastadas do primer podem por vezes não ser amplificadas).

*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Reacção de PCR com sequênciação do produto amplificado (o gene da beta-globina neste caso).

Passo 1: Extracção de DNA genómico (gDNA)

Inicialmente é necessário obter uma amostra celular do doente. Uma maneira relativamente fácil é usar um esfregaço da mucosa oral. Para extrair o gDNA pode usar-se um Kit comercial (ex:http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_mini_man.pdf).

Passo 2: Reacção de PCR Para a reacção de PCR podemos usar também um kit comercial (ex: http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_ep0701.pdf). É necessário escolher primers eficientes que cubram toda a região pretendida, e que sejam específicos. Uma maneira de desenhar primers é utilizar ferramentas bioinformáticas, que têm em conta parâmetros termodinâmicos e permitem o design de primers robustos. (como o Primer-Blast da NCBI).

Neste caso, um exemplo de primers, escolhidos manualmente e que abrangem todo a sequência: Primer esquerdo: GTGTGTATATATATA. Primer direito: TTTTTCCCTTACACC.

Depois da amplificação podia fazer-se uma electroforese em gel de agarose para selecionar apenas os fragmentos amplificados, e evitar que depois primers e fragmentos de amplificação incompleta aparecessem na sequênciação, bem como verificar se a amplificação correu bem.

Passo 3: Sequênciação por método de Sanger, usando por exemplo o primer esquerdo da PCR.

*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo.

Passo 1: Extracção de mRNA. Neste caso seria necessário fazer uma colheita de sangue. Depois de feita a colheita poderia usar-se um kit comercial de purificação de RNA apropriado (ex: http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM1928). Trabalhar com RNA é mais complicado do que DNA, è necessário evitar entre outras coisas a acção das RNAses.

Reacção de PCR

Para a transcrição reversa podia usar-se um primer de oligo-dT, que ligaria à cauda Poly-A, e um kit comercial como o exemplificado com os reagentes necessários. Depois de terminada a síntese de cDNA, faríamos uma reacção de PCR com um protocolo em tudo idêntico ao descrito anteriormente, excepto nos primers, e em seguida sequênciação (tal como no seguimento da questão anterior). Como primers para esta amplificação, poderiamos mais uma vez usar ferramentar informáticas (até se poderia optimizar as temperaturas dos primers de forma a conseguir fazer cDNA e amplificação seguidas, no mesmo tubo, em vez de em dois passos). Dois possíveis primers para esta reacção seriam um primer oligo-dT para o primer direito ou inverso e para o primer directo ou esquerdo: TGTAAACGAAGACT (design manual).



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