User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/03/16

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Aula TP3: Sequenciação de DNA

Questões

  • O que é necessário para fazer uma reacção de sequenciação?

É necessária uma amostra do DNA a sequenciar, um primer complementar à sequencia desse DNA, Taq DNA polimerase, uma mistura de desoxiribonucleótidos (dNTP) e di-desoxiribonucleótidos. Consoante o método utilizado, estes poderão ser fluorescentes (cada um ligado a um fluorocromo distinto) ou não. Neste caso, o primer ou um dos dNTPs terá de ser marcado (com radioactividade ou fluorescência) de forma a permitir a detecção fácil da nova cadeia sintetizada.


  • Que cadeia é sequenciada?

A reacção permite determinar a sequência da cadeia que é idêntica ao primer.


  • Porque se diz que a sequenciação pelo método Sanger é uma sequenciação por terminação?

Porque a determinação da ordem de nucleótidos presente na cadeia de DNA é conseguida através da terminação forçada da síntese de DNA pela Taq DNA polimerase em resultado da incorporação de um didesoxinucleótido. A identificação sucessiva do nucleótido terminador permite deduzir a sequência da cadeia de DNA.


  • Porque motivo a sequenciação não termina no primeiro nucleótido de cada tipo?

Porque os didesoxinucleótido terminadores são incluídos na reacção com uma concentração muito baixa relativamente aos nucleótidos normais, tornando a sua incorporação totalmente aleatória e garantindo uma igual probabilidade de terminação em qualquer dos nucleótidos da cadeia de DNA a sequenciar.


  • Considere o seguinte electroferograma de uma reacção de sequenciação de um DNA purificado. Que problemas consegue observar e porque sucedem?

No início do electroferograma observa-se a sobreposição de picos de grande intensidade, resultando da incapacidade de separar nucleótidos livres dos primeiros fragmentos de sequenciação. No final do electroferograma, a partir dos 380 nucleótidos, observa-se uma da intensidade do sinal (altura dos picos) e uma baixa capacidade de separação dos mesmos (coalescência dos picos). O primeiro aspecto resulta do facto de serem sintetizados menos fragmentos de DNA com esta dimensão devido à probabilidade crescente de incorporação de ddNTPs; o segundo aspecto é uma consequência da dificuldade de resolução electroforética de fragmentos de DNA de maiores dimensões que diferem entre si em apenas 1 nucleótido.


  • O segmento de DNA estudado nesta experiência tem 5 Kpb. Tendo em conta que apenas consegue determinar a sequência de 600-1000 nucleótidos em cada reacção de sequenciação, como dever proceder para analisar o fragmento completo?

A solução mais simples é ir sintetizando novos primers com base na sequência conhecida identificada em cada reacção, tendo o cuidado de deixar uma margem de sobreposição de alguns nucleótidos (~40nt; ver questão anterior). Desta forma iremos "andando" de ~600 em 600 nucleótidos ao longo da sequência de DNA a caracterizar, conseguindo superar o limite de sequenciação imposto pela resolução de reacções individuais.

  • Na imagem seguinte está representada o resultado de uma sequênciação de uma região genómica variável (polimórfica) de 2 indivíduos distintos. Qual o genótipo de cada indivíduo?

Indivíduo 1: Homozigótico para a região sequenciada

Indivíduo 2: Heterozigótico C/G no nucleótido 15 da região sequenciada


  • Suponha que queria sequenciar o gene e o mRNA da beta-globina. Como deveria proceder?

Para sequenciar o gene (1600bp) será necessário efectuar pelo menos 3 reacções de sequenciação independentes, o utilizando primers distintos distribuídos ao longo da sequência do gene. O material biológico a sequenciar pode ser proveniente de qualquer tecido (p.e mucosa bucal).

Para sequenciar o mRNA (630bp) será em princípio necessária apenas uma reacção de sequenciação usando um primer no início do mRNA. No entanto, para sequenciar mRNA será primeiro necessário convertê-lo a DNA por transcrição reversa. Além disso, teremos de utilizar sangue como material biológico, visto que o mRNA da globina só é expresso em células da linhagem eritróide.

Para desenhar os primers será necessário verificar diversos parâmetros relativos às suas características de hibridação, mas de uma forma simplista podemos considerar como um primer para sequenciação uma sequência de 20 nucleótidos idêntica à sequência do gene ou mRNA apresentada, localizada numa posição apropriada para cobrir toda a região de interesse.

  • Considere os resultados da sequenciação discutida no Caso de Estudo 1.
  1. Que aspecto esperaria encontrar no electroferograma na região variável de cada indivíduo?

A mãe e o pai da Maria apresentariam, respectivamente, um pico mais pequeno indicador de heterozigotia no nucleótido 462 ou 732. A Maria apresentaria picos mais pequenos, indicadores de heterozigotia, em ambas as posições.

  1. Se tivesse apenas acesso aos resultados da sequenciação da Maria, seria capaz de definir o seu genótipo com rigor? Justifique.

Não, porque seria impossível perceber se as variações à sequência normal se encontram no mesmo cromossoma ou em cromossomas distintos. Para ocorrer a primeira situação, um dos progenitores teria de ser portador de ambas as mutações, o que não é o caso.


  • Com base na sequência do gene da beta-globina disponível na última TP e as técnicas de análise de sequências que tem vindo a aprender identifique as regiões do gene em que se localizam as alterações pontuais encontradas.

A mutação 462 localiza-se no segundo exão e a 732 no segundo intrão.

Para pensar

  • Se a sequenciação obriga ao conhecimento prévio de um pequeno pedaço de sequência, como foi possível efectuar as primeiras sequenciações?

As primeiras sequênciações foram efectuadas por um método químico que não depende da criação de cópias da molécula a sequenciar pela DNA polimerase e, portanto, não necessita do conhecimento prévio da sequência para desenhas primers.

  • Que estratégias terão sido usadas para sequenciar os milhões de nucleótidos dos vários cromossomas do genoma humano?

O genoma teve de ser partido em segmentos mais pequenos, que foram depois introduzidos em vectores de DNA nos quais hibirdava o primer de sequenciação. Foram utilizadas duas abordagens diferentes: uma que envolveu quebrar o genoma de forma aleatória, mas gerando fragmentos sobreponíveis, sequenciar de uma vez todos os fragmentos obtidos e depois reconstituir a sequência como se fosse um puzzle, usando super-computadores; e outra que começou por gerar um mapa físico do genoma, obtendo primeiro grandes fragmentos que foram mapeados ao respectivo cromossoma e alinhados entre si, e usados como base para gerar fragmentos mais pequenos que foram por sua vez alinhados e sequenciados - ou seja, quando se sequenciava um fragmento já se sabia a que porção do genoma ele correspondia.



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