User:Margarida Gama-Carvalho/Notebook/Undergrad teaching/2010/04/27

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Enzimas de restrição

Exercício 1 – Extremidades e ligações

Considere as seguintes enzimas e respectivas sequências de restrição ( o traço indica a ligação fosfodiéster que é clivada):

Bam HI : G|GATCC Hae II: GG|CC Eco RI: G|AATTC Bgl II: A|GATCT

1. Que característica invulgar tem a sequência de reconhecimento destas enzimas?

Trata-se de uma sequência "palindrómica", ou seja, quando lidas na direcção 5'-3', ambas as cadeias da molécula de DNA apresentam exactamenta a mesma sequência de nucleótidos.

2. Represente as extremidades 5’ e 3’ de moléculas de DNA cortadas com cada uma destas enzimas.

3. É possível ligar uma molécula de DNA com extremidades cortadas por Bam HI a outra com extremidades cortadas por: BamHI? EcoRI? BglII?

É possível ligar extremidades geradas por Bam HI entre si, mas também com extremidades geradas pro BglII, uma vez que os nucleótidos desemparelhados são compatíveis.

No entanto, não é possível ligar extremidades geradas por BamHI e EcoRI.


4. Em média, os fragmentos resultantes da digestão de DNA genómico humano com Bam HI serão maiores ou menores que os fragmentos resultantes de digestão com Hae II? Justifique.

A digestão do genoma com BamHI deve gerar fragmentos de maiores dimensões, visto que o local de corte desta enzima tem menor probabilidade de surgir (6 nucleótidos vs 4 nucleótidos do local HaeII). Assim sendo, a enzima irá cortar o genoma um número menor de vezes e, logo, gerar fragmentos de maiores dimensões.

Exercício 2 – Mapas de restrição

1. A que correspondem as bandas azuis no gel?

Aos corantes de electroforese usados para tornar visível a amostra durante a aplicação e para vizualisar a frente de migração.

2. Considere a digestão do DNA plasmídeo pBR322 com PleI e BglI. Quantos fragmentos de DNA espera, e quantos consegue observar? Porquê?

A digestão com BglI produz 3 fragmentos, que se conseguem observar se de deixar correr a electroforese até ao fim do gel.

A digestão com PleI produz 4 fragmentos, no entanto só se observam 2. Isto explica-se pelo facto de os fragmentos terem dimensões semelhantes entre si, não sendo separados de forma eficiente pelas condições de electroforese utilizadas.

3. Que papel tem a concentração de agarose na análise de fragmentos de restrição?

A concentração de agarose impõe diferentes restrições à migração das moléculas de DNA no gel e vai determinar que gamas de tamanho vão apresentar um comportamento linear na separação. Concentrações demasiado altas impedem a migração de moléculas muito grandes, que não conseguem entrar no gel. Concentrações muito baixas não vão impôr restrições à migração de moléculas pequenas, que vão comportar-se de igual forma na electroforese. Assim, para cada gama de tamanhos a analisar é necessário escolher a concentração de agarose apropriada.


4. Se pretendesse determinar de forma rigorosa o tamanho dos fragmentos de DNA observados na electroforese, como poderia fazê-lo?

Utilizando uma mistura de fragmentos de DNA de tamanho conhecido (marcador) posso gerar uma recta de calibração em que relaciono a distância migrada (em cm) com o tamanho da molécula. Depois só tenho de medir a distância migrada pelos meus fragmentos desconhecidos e deduzir o seu tamanho a partir da recta.


5. Considere a imagem apresentada:

5.1. Poderá corresponder a uma digestão do DNA lambda com a enzima EcoRI ou não? Porquê?

Tendo em conta as posições de corte indicadas, a digestão do DNA lambda com EcoRI produz 6 fragmentos com os tamanhos de: 21226bp, 7421bp, 5804bp, 5643bp, 4878bp e 3530bp. Estes fragmentos são compatíveis com o número e distribuição das bandas observadas na imagem, pelo que é provável tratar-se da digestão de DNA lambda com EcoRI.


5.2. Considerando que a quantidade total de DNA presente neste gel é de um micrograma, relativamente a cada uma das bandas observadas: a. Quantas moléculas de DNA estão na primeira e na última banda observadas no gel?

Por pesquisa no google: a massa molecular do DNA lambda é 31.5 x 10^6 Da, correspondendo a 6.0221415 × 10^23 moléculas, logo, 1 x 10^-6 gr (1μg) correspondem a 1,9 x 10^10 moléculas. Cada banda do gel terá um número idêntico de moléculas, já que correspondem a fragmentos do DNA original.


b. Que quantidade de DNA está nas mesmas bandas?

A primeira banda contém 21226bp/48510bp = 43,8% da quantidade total de DNA aplicado no gel, enquanto que a última banda corresponde a 7,3% (3530bp/48510bp). Desta forma, a quantidade de DNA presente é de 438ng para a primeira banda e 73ng para a última banda.


6. Considere um segmento de DNA de 10000 pares de bases (bps) e os fragmentos formados após digestão com as enzimas EcoRI e HindIII:

  1. DNA x EcoRI = 5000 + 3000 + 2000
  2. DNA x HindIII = 5500 + 4500
  3. DNA x EcoRI x HindIII = 5000 + 3000 + 1500 + 500

Com base nesta informação, construa o mapa de restrição desta molécula.


7. Utilize o Webcutter ou o NEBcutter para gerar um mapa de restrição da sequência do cDNA da beta-globina e indique:

  1. uma enzima de corte único: BamHI;
  2. uma enzima com dois cortes: XhoII;
  3. uma enzima que não corta neste DNA: HindIII.



Exercício 3 – Enzimas de restrição, RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) e diagnóstico de mutações

O gene humano que codifica a beta-globina possui 3 locais de restrição DdeI. A distância entre o primeiro e o segundo local é de 175 bp. A distância entre o segundo e o terceiro local é de 201 bp. Em indivíduos com anemia de células falciformes ocorre uma mutação que anula o segundo local de restrição DdeI.

1. Represente esquematicamente o gene normal e o gene mutado, indicando as posições relativas dos 3 locais DdeI.

2. Proponha um procedimento para diagnóstico desta mutação com base na técnica de PCR.

Utilizando um par de primers que amplifique a região que contém a mutação, mas não os outros locais de corte da enzima DreI (p.ex.primer Fw 100bp antes do local da mutação, primer Rev 150 bp depois do local da mutação), faz-se a amplificação da sequência alvo por PCR a partir de uma amostra de DNA genómico do indivíduo a testar. Em seguida trata-se o produto da reacção de PCR com a enzima DreI e analizam-se os fragmentos de DNA formados por electroforese em gel de agarose.

3. Represente esquematicamente os resultados que espera observar ao analisar um indivíduo saudável, um portador da mutação (heterozigótico) e um doente (homozigótico).




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