User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/23
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PCR e RT-PCRIntroduçãoA técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por isso o método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Questões
Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (ex. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.
Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessárias; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico;
Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA e não apenas de mRNA e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.
1) Amostra biológica: células da mucosa bucal – esfregaço -> hidrólise ácida das células.
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 118 20 58.82 50.00 4.00 1.00 10.00 CATATTCTGGAGACGCAGGA RIGHT PRIMER 2112 20 59.67 45.00 7.00 3.00 11.00 TGCTCAAGGCCCTTCATAAT
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 118 20 58.82 50.00 4.00 1.00 10.00 CATATTCTGGAGACGCAGGA
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 1498 24 58.81 37.50 6.00 2.00 12.00 TGTACACATATTGACCAAATCAGG
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 1049 20 59.94 45.00 2.00 0.00 10.00 ATGGGACGCTTGATGTTTTC
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq LEFT PRIMER 512 20 60.21 50.00 2.00 2.00 11.00 GGCATAAAAGTCAGGGCAGA
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