User:Stefano Mantero/Notebook/Invernizzi Double IHC

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Project Description/Abstract

Lo scopo di questo lavoro e' quello di identificare il tipo cellulare esprimente il recettore CXCR4 in campioni di CCA epatico

  • La colorazione singola per CXCR4 ha dato un elevato fondo mentre migliore si e' dimostrata la doppia colorazione per CXCR4 4 CK7 (marcatore dei colangiociti, sospettati di essere le cellule esprimenti)

In un primo tempo abbiamo utilizzato i reagenti presenti in lab per mettere a punto la doppia colorazione

Protocollo seguito:

  • 2x10’ Bioclear
  • 10’ EtOH 100%
  • 20’ Diva Buffer @ 98°C
  • 3 x 5’ TBST (TBS 0.05% Tween 20)
  • 20’ Peroxabolish (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 20’ Background Sniper (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 1h 30’ Primary antibody mix 1:3000 anti CK7 and 1:200 anti CXCR4 diluited in Da Vinci Green (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 30’ Secondary antibody Mach 2 Double Stain 1 (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 2’ DAB (Biocare)
  • 7’ dH2O
  • 5’ TBST
  • 5’ Ferengi Blue AP substare (Biocare)
  • 7’ dH2O
  • 4’ Nuclear Fast Red (BioOptica)
  • rinse in mQ water
  • Air Dry (in oven)
  • Mount

Image:Doppia1.jpg









In bruno (DAB) e’ evidenziata la presenza di CXCR4; in blu si evidenzia la presenza di CK7; in rosso i nuclei (nuclear fast red) COME SI NOTA QUEST' ULTIMA COLORAZIONE TENDE A SBIADIRE


La colorazione e'stata quindi rifatta utilizzando pero' dei cromogeni specifici per le doppie colorazioni:

  • 2x10’ Bioclear
  • 10’ EtOH 100%
  • 20’ Diva Buffer @ 98°C (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST (TBS 0.05% Tween 20)
  • 20’ Peroxabilish (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 20’ Background Sniper (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 1h 30’ Primary antibody mix 1:3000 anti CK7 and 1:200 anti CXCR4 diluited in Da Vinci Green (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 30’ Secondary antibody Mach 2 Double Stain 1 (Biocare)
  • 3 x 5’ TBST
  • 2’ Warp Red AP substrate (Biocare)
  • 7’ dH2O
  • 5’ TBST
  • 5’ Vina Green HRP AP substrate (Biocare)
  • 7’ dH2O
  • 30” Hematoxilin (Dako)
  • 30” Bluish in TBS
  • rinse in mQ water
  • Air Dry (in oven)
  • Mount with Eukitt












In verde e’ evidenziata la presenza di CXCR4; in rosso si evidenzia la presenza di CK7; in blu i nuclei (ematossilina)

Notes

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  • Example: This project is currently on hold until further notice.


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