User:Maria Ines Goncalves/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/03/23: Difference between revisions
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== | ===PCR e RT-PCR=== | ||
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====Introdução==== | |||
A técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por isso o método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. | |||
A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: | |||
[http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html PCR ] | |||
Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: | |||
[http://www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html RT-PCR] | |||
Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção. | |||
====Questões==== | |||
* Que características deve ter um primer de PCR? | |||
Comprimento do primer (18 a 22 pb); | |||
Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; | |||
Conteúdo em GC (40-60%) - influencia a temperatura de desnaturação; | |||
Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - estabilidade do terminal; | |||
Não ter estruturas secundárias (ex. hairpins); | |||
Evitar repetições de nucleótidos; | |||
Evitar homologia cruzada. | |||
*Como qualquer DNA polimerase, a transcriptase reversa requer um primer iniciador, que pode ser de 3 tipos distintos: específico de gene, oligo-dT ou random (uma mistura aleatória de 6 a 8 nucleótidos). Em que situações pode ser utilizado cada um destes primers e que vantagens/desvantagens relativas apresentam? | |||
Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessárias; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico; | |||
Oligo-dT: desoxinucleótido de timina que hibrida com mRNA num terminal 3' poli-A; Vantagem: com uma única reacção de RT-PCR todos os mRNA são convertidos em cDNA; Desvantagem: como os oligo-dT estão ligados ao terminal, sequências demasiado longas podem não ser convertidas e, além disto, todos os RNA que não tenham a cauda poli-A não são obtidas em cDNA; | |||
Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA e não apenas de mRNA e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes. | |||
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. | |||
*Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. | |||
Revision as of 04:59, 23 March 2010
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PCR e RT-PCRIntroduçãoA técnica do PCR permite obter um grande número de cópias de uma sequência de DNA de interesse a partir de uma quantidade mínima de material. Nas aplicações de maior sensibilidade, uma única molécula de DNA pode ser suficiente para gerar milhões de cópias. Este é por isso o método base para um número muito grande de técnicas de diagnóstico molecular, incluindo em particular os diagnósticos que requerem sequenciação de DNA. A seguinte animação explica o funcionamento da técnica: PCR Quando é necessário proceder à caracterização da expressão de genes, é também possível aplicar a técnica de PCR acoplando-a a uma reacção de transcrição reversa, como explicado na seguinte animação: RT-PCR Note que o resultado de um ensaio de PCR ou RT-PCR tem geralmente de ser visualisado por separação electroforética dos produtos de reacção.
Questões
Comprimento do primer (18 a 22 pb); Temperatura de desnaturação entre 52-58ºC; Conteúdo em GC (40-60%) - influencia a temperatura de desnaturação; Presença de G ou C nas últimas 5 bases do terminal 3' - estabilidade do terminal; Não ter estruturas secundárias (ex. hairpins); Evitar repetições de nucleótidos; Evitar homologia cruzada.
Específico de gene: sequência complementar a um determinado gene de interesse; Vantagem: produção de cDNA correspondente apenas ao gene que se quer estudar, poupando análise de informação desnecessárias; Desvantagem: no estudo de vários genes em simultâneo não é possível pois só são obtidos os resultados do gene para o qual o primer é específico;
Random: usado para gerar cDNA a partir de uma amostra de RNA; Vantagem: melhor obtenção e distribuição das regiões codificantes e não-codificantes; Desvantagem: produção de cDNA de todos os RNA e não apenas de mRNA e com dimensões variáveis, imprevisíveis e que podem ser incompletas e insuficientes.
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